Trapianto di tumore omotrapianto ortotopico: una tecnica per generare modelli murini di tumore pancreatico

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione per il trapianto di tumore

1. Stabulazione degli animali
   1. Ottieni topi C57BL/6 generici da un venditore di allevamenti commerciale.
   2. Topi domestici (5) in gabbie ventilate individuali alle seguenti condizioni: temperatura: 20-26 °C; umidità 30-70%; ciclo di illuminazione: 12 ore di luce e 12 ore di buio.
   3. Usa una lettiera di pannocchia di mais che viene cambiata settimanalmente.
   4. Per la dieta, fornire cibo in granuli secchi sterilizzato con irradiazione durante l'intero periodo di studio.
   5. Per l'acqua, fornire agli animali l'accesso gratuito all'acqua potabile sterile.
2. Preparazione del frammento tumorale del donatore
   1. Iniziare monitorando il peso corporeo (BW), tramite la pesatura con una bilancia, e il volume tumorale (TV), mediante misurazione a calibro, di topi donatori portatori di tumore.
   2. Quando la TV raggiunge i 500-1.200 mm³, sopprimere l'animale in un cappuccio a rischio biologico come da protocollo.
   3. Sterilizzare la pelle intorno al tumore utilizzando tamponi di iodoforo.
   4. Rimuovere chirurgicamente il tumore come da protocollo.
   5. Ispezionare visivamente e mediante palpazione per la presenza di tumori palpabili prima dell'interruzione.
   6. Per l'interruzione, prima sopprimere i topi come da protocollo approvato, aprire l'addome ed esaminare visivamente il pancreas alla ricerca di tumori.
   7. Tagliare il tumore con un intervento chirurgico post-mortale e aggiungerlo al PBS freddo. Metti tutti gli animali in una camera di eutanasia pulita, non carica e traslucida con un coperchio speciale con una porta per l'erogazione dell'anidride carbonica da utilizzare.
   8. Scaricare il gas nella camera a una velocità di flusso che produce una rapida perdita di coscienza con il minimo disagio per l'animale. La portata ottimale per la CO₂ dovrebbe essere di circa 2–2,5 L/min.
   9. Osservare visivamente ogni animale durante la procedura di eutanasia per assicurarsi che tutti gli animali ricevano concentrazioni di gas adeguate e non riprendano conoscenza durante la procedura di eutanasia.
   10. Mantenere il flusso di gas per almeno 1 minuto dopo l'apparente morte clinica per ridurre al minimo la possibilità che un animale possa riprendersi (se apneico ma non morto).
   11. Rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Il tumore pulito può essere fotografato rapidamente.
       Mettere i tessuti tumorali in RPMI-1640 e tenerli in ghiaccio prima della dissociazione.
       nota: Le carcasse degli animali vengono insaccate e conservate nell'apposito congelatore in attesa della rimozione.
   12. Mettere il tumore in una capsula di Petri contenente 20 ml di PBS (pre-raffreddare il terreno o il tampone a 4 °C prima dell'eutanasia degli animali).
   13. Se c'è sangue contaminante, trasferire il tumore in un'altra capsula di Petri e lavare il tumore con PBS.
   14. Tagliare il tumore a metà, rimuovendo la pelle in eccesso, i vasi, le calcificazioni e/o la necrosi.
   15. Scegliere solo pezzi di tumore intatti e metterli in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml e aggiungere 20 ml di PBS, quindi trasportare la provetta in una stanza separata per gli animali per gli studi farmacologici.

2. Impianto ortotopico pancreatico

1. Anestesia e analgesia
   1. Utilizzare un'iniezione di ketamina da 2 ml e un'iniezione di xilazina da 0,42 ml (20 mg/mL) mescolate in 5,91 acqua sterile per iniezione o soluzione fisiologica a un volume di dose di 0,06-0,1 ml/20-25 g di peso corporeo.
      NOTA: In base al benessere degli animali, l'analgesia è necessaria sia prima che dopo l'operazione. 0,05-0,1 mg di buprenorfina/kg, SC. La prima dose è pre-operatoria e poi dosata 3 volte ogni 4 ore dopo l'operazione continuamente.
2. Intervento chirurgico per impianto ortotopico
   1. Anestetizzare i topi tramite iniezione intramuscolare (IM). Anestetizzare l'animale ricevente con isoflurano al 5%, che viene mantenuto da un cono nasale all'1%. L'animale inizierà a rilassarsi, perdendo il riflesso raddrizzante e alla fine diventerà immobile. A questa profondità di anestesia possono essere facilmente svegliati da stimoli dolorosi; Lasciare che l'anestesia si approfondisca fino a quando tali risposte al dolore non sono assenti.
   2. Dopo che gli animali sono stati completamente anestetizzati, fissa i topi su una scheda per esperimenti nella giusta posizione laterale.
   3. Mantieni i mouse nella giusta posizione laterale. Disinfettare la pelle intorno alla milza con iodio, quindi deiodinare con alcol etilico al 75%.
   4. Trova il punto medio della milza e fai un'incisione verticale di 1 cm sull'addome per esporre la milza.
   5. Estrarre delicatamente una parte del tessuto pancreatico sotto la milza con una pinzetta a punta piatta e suturare un pezzo di tumore omotrapianto di topo dal topo seme sul pancreas del topo ricevente mediante sutura chirurgica assorbibile 9-0.
   6. Chiudere l'addome con una sutura di seta 6-0 con doppia cucitura. Ottenere l'omeostasi mediante compressione.
   7. Dopo aver terminato l'impianto del tumore, se non si verificano né sanguinamento né perdite di tessuto tumorale, tenere gli animali in una gabbia calda.
   8. Monitorare l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale; riportare l'animale nella stanza degli animali dopo il completo recupero dall'anestesia. Monitora i topi portatori di tumore palpando l'addome vicino alla milza e seleziona i topi portatori di tumori ortotopici.

3. Monitoraggio della salute dei topi portatori di tumore

1. Controllare quotidianamente il consumo di acqua e cibo.
2. Esamina l'aspetto del topo per un pelo non curato, grumi, magrezza, alito anomalo o ascite.
3. Palpare l'addome per verificare se ci sono tumori spontanei al fegato o alla milza.
4. Pesare i topi settimanalmente utilizzando una bilancia.
5. Se si osserva uno dei seguenti segni clinici, i topi vengono sacrificati per la raccolta del campione e l'autopsia: perdita di peso corporeo >20%; mobilità compromessa (non in grado di mangiare o bere); incapacità di muoversi normalmente a causa di ascite significativa e addome ingrossato; sforzo nella respirazione.