Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione per il trapianto di tumore
- Stabulazione degli animali
- Ottieni topi C57BL/6 generici da un venditore di allevamenti commerciale.
- Topi domestici (5) in gabbie ventilate individuali alle seguenti condizioni: temperatura: 20-26 °C; umidità 30-70%; ciclo di illuminazione: 12 ore di luce e 12 ore di buio.
- Usa una lettiera di pannocchia di mais che viene cambiata settimanalmente.
- Per la dieta, fornire cibo in granuli secchi sterilizzato con irradiazione durante l'intero periodo di studio.
- Per l'acqua, fornire agli animali l'accesso gratuito all'acqua potabile sterile.
- Preparazione del frammento tumorale del donatore
- Iniziare monitorando il peso corporeo (BW), tramite la pesatura con una bilancia, e il volume tumorale (TV), mediante misurazione a calibro, di topi donatori portatori di tumore.
- Quando la TV raggiunge i 500-1.200 mm3, sopprimere l'animale in un cappuccio a rischio biologico come da protocollo.
- Sterilizzare la pelle intorno al tumore utilizzando tamponi di iodoforo.
- Rimuovere chirurgicamente il tumore come da protocollo.
- Ispezionare visivamente e mediante palpazione per la presenza di tumori palpabili prima dell'interruzione.
- Per l'interruzione, prima sopprimere i topi come da protocollo approvato, aprire l'addome ed esaminare visivamente il pancreas alla ricerca di tumori.
- Tagliare il tumore con un intervento chirurgico post-mortale e aggiungerlo al PBS freddo. Metti tutti gli animali in una camera di eutanasia pulita, non carica e traslucida con un coperchio speciale con una porta per l'erogazione dell'anidride carbonica da utilizzare.
- Scaricare il gas nella camera a una velocità di flusso che produce una rapida perdita di coscienza con il minimo disagio per l'animale. La portata ottimale per la CO2 dovrebbe essere di circa 2–2,5 L/min.
- Osservare visivamente ogni animale durante la procedura di eutanasia per assicurarsi che tutti gli animali ricevano concentrazioni di gas adeguate e non riprendano conoscenza durante la procedura di eutanasia.
- Mantenere il flusso di gas per almeno 1 minuto dopo l'apparente morte clinica per ridurre al minimo la possibilità che un animale possa riprendersi (se apneico ma non morto).
- Rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Il tumore pulito può essere fotografato rapidamente.
Mettere i tessuti tumorali in RPMI-1640 e tenerli in ghiaccio prima della dissociazione.
nota: Le carcasse degli animali vengono insaccate e conservate nell'apposito congelatore in attesa della rimozione.
- Mettere il tumore in una capsula di Petri contenente 20 ml di PBS (pre-raffreddare il terreno o il tampone a 4 °C prima dell'eutanasia degli animali).
- Se c'è sangue contaminante, trasferire il tumore in un'altra capsula di Petri e lavare il tumore con PBS.
- Tagliare il tumore a metà, rimuovendo la pelle in eccesso, i vasi, le calcificazioni e/o la necrosi.
- Scegliere solo pezzi di tumore intatti e metterli in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml e aggiungere 20 ml di PBS, quindi trasportare la provetta in una stanza separata per gli animali per gli studi farmacologici.
2. Impianto ortotopico pancreatico
- Anestesia e analgesia
- Utilizzare un'iniezione di ketamina da 2 ml e un'iniezione di xilazina da 0,42 ml (20 mg/mL) mescolate in 5,91 acqua sterile per iniezione o soluzione fisiologica a un volume di dose di 0,06-0,1 ml/20-25 g di peso corporeo.
NOTA: In base al benessere degli animali, l'analgesia è necessaria sia prima che dopo l'operazione. 0,05-0,1 mg di buprenorfina/kg, SC. La prima dose è pre-operatoria e poi dosata 3 volte ogni 4 ore dopo l'operazione continuamente.
- Intervento chirurgico per impianto ortotopico
- Anestetizzare i topi tramite iniezione intramuscolare (IM). Anestetizzare l'animale ricevente con isoflurano al 5%, che viene mantenuto da un cono nasale all'1%. L'animale inizierà a rilassarsi, perdendo il riflesso raddrizzante e alla fine diventerà immobile. A questa profondità di anestesia possono essere facilmente svegliati da stimoli dolorosi; Lasciare che l'anestesia si approfondisca fino a quando tali risposte al dolore non sono assenti.
- Dopo che gli animali sono stati completamente anestetizzati, fissa i topi su una scheda per esperimenti nella giusta posizione laterale.
- Mantieni i mouse nella giusta posizione laterale. Disinfettare la pelle intorno alla milza con iodio, quindi deiodinare con alcol etilico al 75%.
- Trova il punto medio della milza e fai un'incisione verticale di 1 cm sull'addome per esporre la milza.
- Estrarre delicatamente una parte del tessuto pancreatico sotto la milza con una pinzetta a punta piatta e suturare un pezzo di tumore omotrapianto di topo dal topo seme sul pancreas del topo ricevente mediante sutura chirurgica assorbibile 9-0.
- Chiudere l'addome con una sutura di seta 6-0 con doppia cucitura. Ottenere l'omeostasi mediante compressione.
- Dopo aver terminato l'impianto del tumore, se non si verificano né sanguinamento né perdite di tessuto tumorale, tenere gli animali in una gabbia calda.
- Monitorare l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale; riportare l'animale nella stanza degli animali dopo il completo recupero dall'anestesia. Monitora i topi portatori di tumore palpando l'addome vicino alla milza e seleziona i topi portatori di tumori ortotopici.
3. Monitoraggio della salute dei topi portatori di tumore
- Controllare quotidianamente il consumo di acqua e cibo.
- Esamina l'aspetto del topo per un pelo non curato, grumi, magrezza, alito anomalo o ascite.
- Palpare l'addome per verificare se ci sono tumori spontanei al fegato o alla milza.
- Pesare i topi settimanalmente utilizzando una bilancia.
- Se si osserva uno dei seguenti segni clinici, i topi vengono sacrificati per la raccolta del campione e l'autopsia: perdita di peso corporeo >20%; mobilità compromessa (non in grado di mangiare o bere); incapacità di muoversi normalmente a causa di ascite significativa e addome ingrossato; sforzo nella respirazione.
