Colorazione anticorpale dei melanociti a squame: una tecnica per rilevare i fattori di trascrizione espressi nei melanociti associati alla squama dorsale di modelli di zebrafish

In questo articolo

Abstract

Fonte: Sharanya Iyengar et al. Screening per i modificatori del melanoma utilizzando un modello di tumore autoctono Zebrafish. J. Vis. Exp. (2012)

Questo video descrive il metodo di colorazione degli anticorpi per rilevare l'espressione dei fattori di trascrizione nei melanociti associati alla squama dorsale di modelli di zebrafish. Questa tecnica di immunocolorazione aiuta a identificare in modo specifico il fattore di trasfezione A che induce i melanociti nel pesce zebra transgenico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Colorazione anticorpale dei melanociti in scala

Preparare il tampone PO₄ con 80 mL 0,1M Na₂HPO₄ e 20 mL 0,1M NaH₂PO₄. Assicurati che il pH sia 7,3. Preparare 2x tampone fisso contenente 8,0 g di saccarosio, 0,15 mL 0,2M CaCl₂ e 90 mL 0,2M PO₄ tampone, pH 7,3. Se necessario, regolare il pH a 7,3 con NaOH o HCl, quindi portare a 100 ml con tampone PO₄.
Pesare fino a 300 mg di PFA solido e aggiungerlo a una provetta per microcentrifuga. Aggiungere 5 mM di NaOH a un volume pari a 4,5 volte la massa, in mg, di PFA (ad es. 450 ul 5 mM NaOH a 100 mg di PFA). Riscaldare a 60-70 °C agitando di tanto in tanto fino a quando il PFA non si sarà sciolto. Centrifuga il particolato rimanente e recupera il 20% di surnatante PFA. Rendilo fresco ogni volta.
Preparare una soluzione di fissazione contenente 1x tampone di fissaggio e PFA al 4%.
Anestetizzare il pesce in 0,17 mg/mL di tricaina.
Utilizzando la luce incidente al microscopio da dissezione, prelevare le squame dorsali utilizzando una pinza affilata a punta fine, facendo attenzione a non danneggiare la metà della squama contenente melanociti (Figura 1A). Posizionare le squame direttamente dalla pinza in una soluzione di fissazione da 1 mL e incubare a temperatura ambiente, mentre si gira, per ≥ 2 ore. Trasferisci il pesce nell'acqua del pesce e monitora il pesce per confermare il successo del recupero.
Per decolorare i melanociti pigmentati, lavare le squame fisse in PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 volte per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di soluzione di candeggina appena preparata contenente 0,4 mL di 10% KOH e 0,15 mL di 30% H₂O₂ in 5 mL con dH₂O. Applicare parafilm o chiusure per evitare che il gas apra le provette. Continuare a decolorare fino a quando il pigmento non è scomparso (10 minuti è tipico) (Figura 1B, C). Lavare in PBST quattro volte per 5 minuti a temperatura ambiente.
Bloccare per almeno 30 minuti in una soluzione a blocchi composta da 1x PBS pH 7,4, Triton X-100 allo 0,2%, 2 mg/mL di BSA, DMSO all'1%, NaN₃ allo 0,02% e siero di agnello al 2%. Omettere NaN₃ se si sviluppa con reazione HRP.
Incubare con l'anticorpo primario in soluzione a blocchi per una notte a temperatura ambiente. È necessario disporre di almeno 400 μL di soluzione sui campioni per mantenerli sommersi.
Lavare la bilancia 3 volte per 30 minuti in PBST a temperatura ambiente.
Incubare con anticorpi secondari da 2 ore a notte in soluzione a blocchi a temperatura ambiente.
Colorare per 10 min con PBST + 0,1 μM DAPI.
Lavare 3 volte per 5 minuti con PBST.
Montare la bilancia su un vetrino in una goccia di vectashield in modo che il lato concavo della guancia sia rivolto verso il basso verso il vetrino e posizionare un vetrino di copertura su di esse. Sigillare i bordi del vetrino con smalto trasparente e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza (Figura 1D, E, F, G).

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Risultati

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Figura 1. Colorazione anticorpale dei melanociti delle squame. A) Squame prelevate da un pesce zebra miniCoopR-EGFP anestetizzato. B) squame non sbiancate con melanociti pigmentati e C) squame sbiancate di pesce zebra miniCoopR-EGFP. Barra della scala = 100 μM. Scala non sbiancata colorata con un anticorpo D) Mitfa...