Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Sommario

Descriviamo un metodo per la visualizzazione ripetutamente microglia murina e monociti circolanti In vivo Più di ore, giorni o settimane utilizzando transcranico microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare un assottigliato-teschio finestra che permette l'osservazione intermittenti di microglia quiescenti che possono essere attivate mediante iniezione stereotassica adiacenti del virus HIV-1 proteina regolatrice Tat.

Abstract

Tradizionalmente nel campo delle neuroscienze, l'imaging in vivo due fotoni del murino sistema nervoso centrale o ha comportato l'uso di open-cranio ^1,2 o diluito ^cranio-3 preparati. Mentre la tecnica open-cranio è molto versatile, non è ottimale per lo studio microglia, perché è invasiva e può causare l'attivazione della microglia. Anche se il diradamento-cranio approccio mini-invasivo, le ripetute ri-assottigliamento del cranio necessari per l'imaging cronica aumenta il rischio di danno tissutale e attivazione della microglia e permette per un numero limitato di sessioni di imaging. Qui vi presentiamo una malattia cronica sottile cranio metodo della finestra per il monitoraggio microglia murini in vivo per un periodo prolungato di tempo utilizzando la microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare una stalla, accessibile, assottigliato-cranio finestra corticale (TSCW) con un coprioggetto di vetro traslucido apposto che rimane nel corso di tre settimane di osservazione intermittente. Questa preparazione è molto più TSCW immunologicamente inerte rispetto alla attivazione della microglia di craniotomia aperti o cranio ripetuti assottigliamento e permette un numero arbitrario di sessioni di imaging durante un periodo di settimane. Prepariamo TSCW in CX ₃ GFP CR ₁ / ⁴ + mouse per visualizzare microglia con maggiore proteina fluorescente verde a ≤ 150 micron sotto la superficie piale. Mostriamo anche che questa preparazione può essere utilizzato in combinazione con iniezioni cerebrale stereotassica della proteina HIV-1 Tat neurotossici, adiacente al TSCW, che è in grado di indurre microgliosis durevole. Pertanto, questo metodo è molto utile per esaminare i cambiamenti nella morfologia e la motilità della microglia nel corso del tempo nel cervello che vivono in modelli di Disturbo da HIV Associated neurocognitive (mano) e di altre malattie neurodegenerative con una componente neuroinfiammatorie.

Protocollo

1. Preparare l'Animale per l'imaging

1. Nei nostri esperimenti, usiamo adulto CX ₃ CR ₁ topi GFP / + che esprimono GFP in linee di cellule mononucleate, tra cui la microglia. ⁴ ceppi diversi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico progetto.
2. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail di tre farmaci che consiste di 0,05 mg / kg di fentanyl, 5,0 mg / kg di Midazolam, e 0,5 mg / kg medetomidina ^5. Preparazione chirurgica per TSCW inizia dopo che l'animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come come un pizzico coda. In tutto l'intervento chirurgico e di imaging, manteniamo l'animale su una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia post-anestesia. Se necessario, una dose di richiamo di un terzo la dose originale del cocktail anestetico può essere dato per ripristinare il piano originale anestetico.
3. Coprire gli occhi dell'animale con una pomata oftalmica di protezione per mantenere gli occhi umidi durante l'anestesia, che sopprime riflesso lampeggiare dell'animale. Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto del animale con un rasoio, cesoie, forbici, o metodi chimici. Disinfettare il cuoio capelluto con un 10% di povidone-iodio soluzione e il 70% di etanolo. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave, sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore, o disinfettata con etanolo al 70%.
4. Effettuare una incisione mediana del cuoio capelluto con le forbici piccole, a partire 4-5 mm caudale al cranio e avanzando in avanti verso la parte anteriore degli occhi. E 'importante che questa incisione essere abbastanza lungo che la pelle non interferirà con l'incollaggio della piastra di testa che viene utilizzato per stabilizzare la testa mouse durante due fotoni di imaging (Figura 1). Identificare l'area da diluire in un ambito di dissezione. Evitare le zone di interesse direttamente trova oltre suture craniche, come il cranio è meno stabile in questi settori e grandi vasi sottostanti e meningi interferirà con l'imaging.
5. Applicare il 100% di etanolo al 10% seguita da una soluzione di cloruro ferrico con un tampone di cotone sterile per asciugare le membrane sulla parte superiore del cranio e raschiare via con pinzette multa o una lama di rasoio. La mancata rimozione dei risultati membrane in allegato instabile piastra di testa.
6. Mettere uno strato sottile di Permabond 910 colla intorno ai bordi della finestra di visualizzazione sotto la piastra di testa. Posizionare la piastra di testa ricoperti di colla su tutta l'area di interesse sul cranio dell'animale con una leggera pressione (Figura 1). E 'importante che la piastra di testa è solo incollata alle ossa del cranio. Ogni pelle o delle membrane che sono in bilico tra la piastra di testa e il cranio si riduce la stabilità del vincolo. Applicare una piccola quantità di acrilato all'interno della finestra di visualizzazione utilizzando una siringa immediatamente legame colla. Infine, applicare una piccola quantità di Loctite 454 ai bordi della finestra di visualizzazione per evitare perdite.
7. Avvitare la piastra di testa al titolare animale (Figura 1) e verificare la stabilità della piastra testa sotto un campo di applicazione dissezione con una leggera sondando con un paio di pinze. Ci dovrebbe essere alcun movimento del cranio rispetto alla piastra di testa. Mettere una goccia di soluzione salina sulla finestra di visualizzazione per garantire non vi siano perdite.

2. Preparare la finestra Cranio Assottigliato corticale

1. In preparazione per diluire il teschio, il cranio a secco utilizzando una combinazione di tamponi di cotone sterile e aria compressa. Inizialmente abbiamo sottile il cranio con una punta sterile IRF 007 in un trapano Microtorque II insieme a 4000 giri. Molto delicatamente, iniziare diradamento uno spazio 2-2,5 mm di diametro circolare del cranio. Usare i movimenti radicali solo la luce quasi parallelo al cranio, non utilizzare una pressione diretta verso il basso. Smettere di foratura ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere delle ossa che utilizzano l'aria compressa. Queste interruzioni nella perforazione del cranio permettono di raffreddare quindi non c'è il calore indotto danni al tessuto cerebrale sottostante.
   1. Come la perforazione progredisce, si noti la transizione verso lo strato umido osso spugnoso (cioè la "diploe"). Una volta che questo strato si raggiunge, prestare particolare attenzione in più con il trapano.
2. Di tanto in tanto controllare la magrezza del cranio mettendo salina sopra la zona assottigliata e la visualizzazione nel campo d'applicazione dissezione. Saline consentirà inoltre la dissipazione del calore. Mentre il cranio è assottigliato, più piccolo vascolarizzazione diventa visibile.
3. Utilizzare un MicroBlade sterile dentale per raggiungere la finale assottigliamento in soluzione salina, in quanto il MicroBlade fornisce un feedback tattile molto di più circa la stabilità del cranio. Questo permette di preparazioni molto più sottile con il trapano da solo. Dalla nostra esperienza, lo spessore cranio ottimale è 10-30 micron.
   1. E 'importante verificare la sottigliezza del cranio in epifluorescenza più volte durante i primi tentativi di fare un po' alla finestra sottile cranio. La nitidezza e la profondità del visibile microglia e vascolarizzazione dare una buona indicazione su quando la finestra è pronta per l'imaging.
4. Una volta che la finestra è pronta, colla una custom-made pezzo rettangolare di # 0 coprioggetti wi ° una dimensione inferiore a 2 mm su ogni lato oltre la finestra. Utilizzando un diametro di 1,0 millimetri pipetta di vetro, posto una piccola goccia di colla cianoacrilato sulla zona cranio assottigliato e con attenzione più in basso il piccolo pezzo di coprioggetti, quindi premere leggermente contro il cranio di spremere quantità in eccesso di colla. E 'importante evitare la formazione di bolle tra il vetro e la colla poiché l'aria intrappolata causerà l'area sottostante per diventare otticamente opaco. La colla cianoacrilato è utilizzato perché rimane trasparente quando asciutto e impedisce anche la ricrescita dell'osso e membrana mantenendo il teschio sotto la finestra sottile e traslucida. Se c'è qualche colla sulla parte superiore del vetro di copertura, utilizzare il MicroBlade per rimuoverla con cautela una volta che il vetro di copertura è a posto e la colla è asciutta.
5. Un analgesico (ad esempio, Buprenorfina 2 mg / kg sottocute) è somministrata immediatamente dopo l'intervento e ri-somministrato in qualsiasi segni di dolore, tra cui riluttanza a muoversi, mangiare o bere, perdita di peso, salivazione, piloerezione, suoni respiratori, ecc

3. A due fotoni Imaging

1. In preparazione a due fotoni di imaging, coprire il TSCW con soluzione salina e individuare l'area di interesse in epifluorescenza (Figura 2). Per consentire l'imaging successive della zona, scattare una foto utilizzando una macchina fotografica.
2. Per i due fotoni di imaging, si usa una misura microscopio a due fotoni ⁶ con un laser Ti: zaffiro sintonizzati nm 920. Fluorescenza viene rilevata da un tubo fotomoltiplicatore per intero campo modalità di rilevazione e un 580/180 filtro per le emissioni. A 20X acqua-immersion lente (0,95 NA) è usato per tutta la sessione di imaging. La potenza massima della potenza laser, l'obiettivo è impostata tra 50 e 65 mW.
3. Selezionare una zona di interesse in strati corticali I o II (fino a 150 micron sotto la superficie piale). Per facilitare il re-imaging, scattare foto dello stesso campo visivo a 1X, 2X, 3X e zoom digitale. I vasi sanguigni possono servire come punti di riferimento per trovare facilmente lo stesso campo di vista durante le sessioni di imaging successive. Sotto di uno zoom 3X, più z-stack con 80-90 Z-passi in ogni pila e un passo 0,69 micron possono essere acquisiti ogni 5 minuti per un massimo di 30 minuti, che consente un buon campionamento di microgliali morfologia e comportamento nel tempo ( Figura 3). Tra le acquisizioni di z-stack, si dovrebbe verificare il livello di soluzione salina negli TSCW, così come la profondità degli animali di anestesia.

4. L'iniezione del virus HIV-1 Neurotossina, Tat

1. In primo luogo, silanize il rivestimento interno di un ago calibro 35 e siringa da 10 microlitri microvolumi per evitare deposizione Tat. Prelevare la soluzione silanizzazione (Sigmacote) fino a riempire sia l'ago e siringa. Lasciare che la soluzione di sedersi per 5 minuti a temperatura ambiente. Svuotare la soluzione dalla siringa, togliere il pistone, e consentire la siringa e l'ago si asciughi completamente. Infine, lavare la siringa e l'ago accuratamente con acqua deionizzata.
2. Eseguire una piccola craniotomia 0,5 millimetri di diametro o 3 millimetri rostrale o laterale alla TSCW in cui due fotoni immagini sono state ottenute, con una punta più piccola e con attenzione assottigliamento del cranio fino a un paio di pinze con punte taglienti in grado di rimuovere lo strato diluito di osso via facilmente. Noi usiamo una siringa da 10 microlitri microvolumi dotato di 35 gauge controllato da una pompa siringa Ultramicropump III montato su un 3-asse micromanipolatore e dopo allineando la punta dell'ago alla craniotomia, è attentamente avanzato ad una profondità di 700-900 micron al di sotto la superficie piale cui 3 ml Tat _1-72 (o altri agenti pro-infiammatorie) o di soluzione fisiologica (o veicolo di controllo) viene consegnato a 80 Nl / min.

5. Animal Housing

1. Se l'animale deve essere ripreso più volte in un solo giorno, coprire l'area aperta del cranio con un misto di pomata oftalmica e vaselina per evitare disagi o danni al cranio tra le sessioni di imaging. Scollegare il ponte di sostegno dal piccolo testa-plate (vedi Figura 1B) e posto l'animale in una gabbia con cibo riscaldato facilmente accessibile e acqua. Tutti gli animali devono essere alloggiati singolarmente dopo l'intervento in ogni momento. Una volta che le sessioni di imaging per un animale sono complete per un dato giorno, rimuovere con attenzione l'intera testa piastra e suturare la pelle indietro al cranio con # 6 o più piccole suture. Ancora una volta, la casa gli animali singolarmente con il cibo facilmente accessibili e acqua tra i giorni di sperimentazione. Controllare ogni giorno gli animali per rilevare eventuali segni di stress, dolore o infezione.

6. Rappresentante Risultati

Figura 1. Stabilizzazione di animali per la chirurgia e due fotoni di imaging (A) e la piastra di progettazione testa (B).

Figura 2. GFP-etichettata microglia visualizzate con epifluorescenza.

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Figura 3. GFP-etichettata microglia visualizzati con due fotoni immagini dopo l'impianto del TSCW, circa 50 micron sotto la superficie piale. Il singolo a due fotoni sezioni presa 15-30 minuti dopo l'impianto del TSCW (giorno 0), così come 7 e 17 giorni più tardi, dimostrare che le finestre rimane chiaro microglia mentre restano inattivati ​​in assenza di insulti infiammatori. Lo z-proiezioni preso 6 e 24 ore dopo l'iniezione del virus HIV tat mostra neurotossina impressionanti cambiamenti morfologici di microglia attivata. Scala grafica: 10 micron.

Discussione

Vi è un consenso crescente che il substrato reale per l'HIV-1 deficit neurocognitivi associati (mano) è la distruzione di architettura sinaptica, presumibilmente causata da mediatori pro-infiammatori rilasciati da HIV-1 infetti fagociti mononucleari. Attivazione della microglia, cellule giganti multinucleate e gliosi a causa di ipertrofia degli astrociti sono considerate caratteristiche non specifiche di HIV-1 e l'infiammazione del sistema nervoso centrale ^7. Al contrario, la gravità della malattia neurologica premortem è stata correlata con la perdita di complessità sinaptica, così come fardello dei macrofagi nel SNC ^8,9,10,11. Tuttavia, le interazioni dinamiche tra microglia, macrofagi periferici infiltrazione, e neuroni nei pazienti con MANO semplicemente non possono essere modellati con i convenzionali di lavorazione statici ottenuti da studi convenzionali immunocitochimica. Recenti studi nei nostri laboratori hanno suggerito che almeno alcune di queste interazioni tra le cellule mononucleate periferiche e centrali e neuroni possono essere modellati in parte mediante iniezione stereotassica di HIV-1 proteina Tat _1-72 nel parenchima cerebrale (Lu, Marker, Tremblay, Qi, e Gelbard, dati non pubblicati). Abbiamo quindi deciso di applicare l'imaging in vivo due fotoni per esaminare l'interazione tra monociti-macrofagi derivati, residente microglia e neuroni del cervello, in un modello animale docile piccolo per neuroAIDS. Mentre aperto cranio o diluito-cranio preparati permettersi un singolo esame di architettura corticale per un breve periodo di tempo (in ore), i ricercatori interessati nel corso di tempo degli eventi subacuta non può usare queste preparazioni senza artifactually attivare microglia / macrofagi a causa della manipolazione chirurgica del la finestra cranica. Qui mostriamo un modo semplice per aggirare queste limitazioni incollando un piccolo pezzo di vetro coprioggetto sopra la zona cranio assottigliato prevenire la calotta cranica di rigenerarsi nel TSCW così come mantenere la trasparenza per ≥ 3 settimane. Abbiamo inoltre dimostrato che questa tecnica ci permette di monitorare il comportamento dei monociti periferici entrare microcircolo cerebrale e cervello residenti microglia in risposta a iniezione stereotassica di HIV Tat _1-72 nella corteccia di topi eterozigoti per CX ₃ CR ₁ / GFP ( per identificare le cellule mononucleate del lignaggio). Questa tecnica può essere facilmente adattato per l'uso su topi con diverso background genetico, ad esempio, si usano abitualmente eterozigoti CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² topi per indagare le interazioni tra le derivate da monociti macrofagi, microglia residente cervello e neuroni modelli in vivo di neuroinfiammazione rilevanti per MANO. La nostra preparazione TSCW consente agli investigatori di studiare interazioni cellula-cellula tra la periferia e sistema nervoso centrale che possono verificarsi in periodi di settimane, in cui l'animale può essere più volte ripreso, prima e dopo il trattamento sperimentale. Così, ogni animale può servire come proprio controllo. Un avvertimento per questo modello TSCW è che le cellule bersaglio sotto inchiesta devono essere geneticamente per esprimere una maggiore proteine ​​fluorescenti (eXFP) o essere marcati con un colorante fluorescente senza violazione meccanica della calotta cranica, e che l'espressione eXFP devono essere sufficientemente robuste per permettono architettura cellulare da visualizzare dopo le sessioni di imaging ripetuti per un periodo di settimane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Citrato di fentanil	Hospira Inc.
Cloridrato di midazolam	Baxter Internationl Inc.
Cloridrato di medetomidina (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Pad riscaldanti	Beyond Bodi Heat
Unguento oftalmico a base di tobramicina e desametasone (TobraDex)	Alcon
Soluzione al 10% di iodopovidone	Betadine Puredue Pharma
Soluzione al 10% di cloruro ferrico	Ricca Chemical Company	3120-32
Metil cianoacrilato 910	Permabond
Cianoacrilato 454	Loctite
Materiale per protesi dentarie TEETS con reticolazione di metilmetacrilato	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Kit per manipolo Microtorque II	Pearson Assessments	R14-0002
Frese IRF 007	Fine Science Tools	19008-07
Lama microchirurgica pieghevole Norland, raggio completo	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cianoacrilato	The Original Superglue
Coprioggetto in vetro #0	Electron Microscopy Sciences	63750-01
Siringa microvolumetrica da 10 μl	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
Ago NanoFil calibro 35	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Macinino a sfera, inserti in carburo #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Tubo fotomoltiplicatore	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Laser a Ti:sapphire Mai-Tai	Newport Corp.