La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.
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Articolo metodologico
ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto
In questo articolo
Sommario
Abstract
DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente letali e genotossici, che possono derivare sia da processi endogeni (fisiologici o patologici) o da fattori esogeni, in particolare le radiazioni ionizzanti e composti radiomimetici. Fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX, è una risposta precoce al DNA a doppio filamento
Protocollo
Tessuti
- Tessuto polmonare, incorporati in stampi in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto 4583, è stato sezionato (5 micron) utilizzando un criostato Leica CM 1950, montato su poli-L-lisina diapositive.
I campioni congelati sono stati ottenuti dal dottor Simon Royce a bambini di Murdoch Research Institute. Tessuto polmonare è stato ottenuto da Balb non trattata / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree che mostra molte delle caratteristiche patologiche di asma umano 6. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Comitato Etico della Animal Research Institute Children Murdoch che aderisce al Codice di Pratica australiano per la cura e l'uso di animali da laboratorio per scopi scientifici.
- Le sezioni sono stati lasciati asciugare all'aria a temperatura ambiente per 1 ora.
Immunofluorescenza
- Le sezioni sono stati fissati con il 2% (w / v) paraformaldeide in tampone fosfato (PBS) per 20 minuti.
- Sezioni sono state equilibrata con due lavaggi in PBS per 15 minuti ciascuno.
- Le sezioni sono state trattate con etanolo al 70% (refrigerate a -20 ° C) per 20 minuti, seguita da tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno.
A questo punto i vetrini possono essere conservati in contenitori sigillati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
- Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna e quindi bloccato con 100μL preparati al momento in PBS contenente 8% di BSA in PBS contenente 0,5% Tween-20 e dello 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) per 1 ora a temperatura ambiente .
Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificato. - Sezioni sono state lavate con PBS-TT per 5 minuti e un perimetro idrofobico è stato segnato in tutto il tessuto con una penna Pap.
- Tampone in eccesso è stata una soffiata e 100μl di primario policlonale di coniglio anti-γH2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA in PBS, Millipore), è stata aggiunta ad ogni sezione per un 2 ore di incubazione a temperatura ambiente.
Incubazione con anticorpo primario può essere eseguito durante la notte a 4 ° C.
Per ulteriori prove, che rappresentano focolai γH2AX DSB, un anticorpo primario riconoscere una proteina riparazione DSB può anche essere usato. Per esempio, co-localizzazione di γH2AX e fosfo-ATM è una combinazione di uso comune. - Le sezioni sono state lavate due volte in PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio diluito 1:500 in 1% BSA, Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente al buio . (Anticorpo diluito è stato tenuto al buio tutta la procedura).
- Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubate con 0.5mg/mL RNase A per 30 minuti a 37 ° C.
- Nucleare di contrasto e di montaggio è stato eseguito con mezzo Vectashield contenenti ioduro di propidio.
- I vetrini sono stati sigillati con smalto e conservato durante la notte a 4 ° C al buio prima dell'analisi.
Microscopia / Analisi
- A Meta Zeiss LSM510 microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio) e PI (543 nm).
Le immagini sono state acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Durante l'analisi, i piani individuali sono stati deconvoluted e impilati per produrre una immagine proiettata al massimo per minimizzare la sovrapposizione dei focolai.
Il metodo di creazione di una immagine proiettata al massimo prima di un numero di particelle deve essere utilizzato solo in circostanze in cui viene utilizzata una sezione sottile (ad esempio 5 micron) e dove la colorazione di fondo è insignificante. Dove più spesso le sezioni con un significativo background deve essere analizzato, una analisi più complesse come Contatore oggetto 3D come descritto da Bolte e Cordelieres (2006) deve essere usato 7.
- Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per creare fusi (rosso e verde) immagini per quantificare il numero di focolai.
Anche se Metamorph può essere utilizzato per quantificare i numeri focolai, derivante dall'uso di sezioni di tessuto focolai vengono conteggiati manualmente (ad occhio) per una maggiore precisione.
Specifici tipi cellulari di interesse possono essere selezionati per la quantificazione, per esempio le cellule epiteliali del polmone. Ciò può essere fatto sulla base di istologia e con riferimento al ematossilina e eosina sezioni colorate seriale.
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Discussione
Ai fini di questa dimostrazione abbiamo usato tessuto polmonare del mouse non trattati da Balb / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree. Abbiamo quantificato differenze nel numero di focolai per cella con medie leggermente più alto osservato nei polmoni danneggiati rispetto a sezioni non trattati. In particolare, la quantificazione indicato per 6,5 focolai / cellulare e del 9,4 per focolai / cella (conteggio manuale di 20 cellule per sezione), nei tessuti non trattati e cronica ma...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro. MMT è grata per l'assistenza di esperti e la consulenza del Dr. Olga Sedelnikova dal National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | L'BSA (1%) viene utilizzato per bloccare qualsiasi legame non specifico degli anticorpi. Gli anticorpi primari e secondari vengono diluiti in BSA. | |
| PBS (senza Ca)2+ e Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Composto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Vetrini Polysine | Menzel-Glaser | SF41296SP | Attrae elettrostaticamente sezioni di tessuto congelato e riduce la necessità di rivestimenti e adesivi aggiuntivi. |
| Tween 20 | Reagente | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5%) è un detergente utilizzato per permeabilizzare le cellule |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0,1%) utilizzato per permeabilizzare le cellule. |
| Paraformaldeide | Reagente | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-fosfo-γH2AX (anticorpo policlonale da coniglio) | Anticorpo primario | Upstate, Millipore | 07-164 | Diluizione dell'anticorpo primario (1:500) in BSA al 1%. |
| Alexa Fluor 488 anticorpo caprino anti-coniglio IgG (H+L) | Anticorpo secondario | Invitrogen | A-11008 | Diluizione dell'anticorpo secondario (1:500) in BSA al 1%. |
| Etanolo (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagente | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagente | Vector Laboratories | H-1300 | Un mezzo di montaggio a base di glicerolo contenente ioduro di propidio (un colorante nucleare rosso). Questo mezzo deve essere utilizzato con un obiettivo a immersione in olio che corrisponda al suo indice di rifrazione. Nota: colorante per DNA comunemente utilizzato: 4,6-diamidino-2-fenilindolo diidrocloruro (DAPI). Può essere utilizzato solo con microscopi dotati del laser di eccitazione appropriato. |
| Mini penna PAP | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslip (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Vaso Coplin, in vetro | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Vasca di colorazione | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocale | Microscopio confocale | |||
| CM Leica 1950 Criostato | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software per l'analisi delle immagini | Molecular Devices |
Riferimenti
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
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Ristampe e permessi
