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Abstract

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in motoneuroni funzionali spinali e cranici utilizzando vettori PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la procedura per generare motoneuroni mediante trasfezione di iPSC umane con il sistema di trasposoni PiggyBac mediante l’espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per il lignaggio.

Protocol

1. Generazione di linee iPSC inducibili NIL e NIP

1. Trasfezione cellulare
   1. Sciacquare le cellule con PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libero).
   2. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a quando le singole cellule sono
   3. separati (5-10 min).
   4. Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
   5. Raccogliere in una provetta da 15 mL e aggiungere PBS (Ca^2+/Mg²⁺ free) a 10 mL. Conta le celle.
   6. Pellettare 10⁶ celle e risospendere in 100 μl di Buffer R (incluso nel kit di elettroporazione delle celle, vedi Tabella dei Materiali).
   7. Aggiungere DNA plasmidico per la trasfezione: 4,5 μg di vettore trasponibile (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg del plasmide piggyBac trasposasi.
   8. Trasfettare con il sistema di elettroporazione della cella (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri: tensione 1.200 V, larghezza 30 ms, 1 impulso. Seminare le cellule in terreno iPSC umano integrato con 10 μM di Y-27632 (inibitore di ROCK, vedi Tabella dei materiali) in un piatto rivestito di matrice di 6 mm.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival