Editing genico mediato da trasposone PiggyBac nelle iPSC umane: una procedura per integrare il gene di interesse nelle iPSC umane utilizzando il sistema di trasposoni PiggyBac

Published: April 30, 2023
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Abstract

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in motoneuroni funzionali spinali e cranici utilizzando vettori PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la procedura per generare motoneuroni mediante trasfezione di iPSC umane con il sistema di trasposoni PiggyBac mediante l’espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per il lignaggio.

Protocol

1. Generazione di linee iPSC inducibili NIL e NIP

  1. Trasfezione cellulare
    1. Sciacquare le cellule con PBS (Ca2+/Mg2+ libero).
    2. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a quando le singole cellule sono
    3. separati (5-10 min).
    4. Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
    5. Raccogliere in una provetta da 15 mL e aggiungere PBS (Ca2+/Mg2+ free) a 10 mL. Conta le celle.
    6. Pellettare 106 celle e risospendere in 100 μl di Buffer R (incluso nel kit di elettroporazione delle celle, vedi Tabella dei Materiali).
    7. Aggiungere DNA plasmidico per la trasfezione: 4,5 μg di vettore trasponibile (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg del plasmide piggyBac trasposasi.
    8. Trasfettare con il sistema di elettroporazione della cella (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri: tensione 1.200 V, larghezza 30 ms, 1 impulso. Seminare le cellule in terreno iPSC umano integrato con 10 μM di Y-27632 (inibitore di ROCK, vedi Tabella dei materiali) in un piatto rivestito di matrice di 6 mm.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

B27Miltenyi Biotec 130-093-566Serum free supplement for neuronal cell maintenance
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>Sigma-AldrichC3881Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EFreezing medium for human iPSCs
DispaseGibco17105-041Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLBasal medium for cell culture
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1GUsed to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2UWiCellUWWC1-DS2UCommercial human iPSC line
GDNFPreproTech450-10Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Commercial human iPSC line
HepesSigma-AldrichH4034Chemicals for electrophysiological solutions
LamininSigma-Aldrich11243217001Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAAThermo Fisher Scientific11140035Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Cell electroporation kit
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Cell electroporation system
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FFBiological Industries05-100-1AHuman iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> freeSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333-100MLPenicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)Enzo Life SciencesALX-270-333-M005Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival

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PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

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PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).

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