Editing genico mediato da trasposone PiggyBac nelle iPSC umane: una procedura per integrare il gene di interesse nelle iPSC umane utilizzando il sistema di trasposoni PiggyBac
Questo video dimostra la procedura per generare motoneuroni mediante trasfezione di iPSC umane con il sistema di trasposoni PiggyBac mediante l’espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per il lignaggio.
Protocol
1. Generazione di linee iPSC inducibili NIL e NIP
Trasfezione cellulare
Sciacquare le cellule con PBS (Ca2+/Mg2+ libero).
Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) (0,35 mL per una piastra da 35 mm) e incubare a 37 °C fino a quando le singole cellule sono
separati (5-10 min).
Completare delicatamente la separazione cellulare pipettando su e giù con un pipettatore P1000 3-4 volte.
Raccogliere in una provetta da 15 mL e aggiungere PBS (Ca2+/Mg2+ free) a 10 mL. Conta le celle.
Pellettare 106 celle e risospendere in 100 μl di Buffer R (incluso nel kit di elettroporazione delle celle, vedi Tabella dei Materiali).
Aggiungere DNA plasmidico per la trasfezione: 4,5 μg di vettore trasponibile (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg del plasmide piggyBac trasposasi.
Trasfettare con il sistema di elettroporazione della cella (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri: tensione 1.200 V, larghezza 30 ms, 1 impulso. Seminare le cellule in terreno iPSC umano integrato con 10 μM di Y-27632 (inibitore di ROCK, vedi Tabella dei materiali) in un piatto rivestito di matrice di 6 mm.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
B27
Miltenyi Biotec
130-093-566
Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker
Nippon Genetics
NGE-BB02
Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>
Sigma-Aldrich
C3881
Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix
Corning
354277
Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA
Biological Industries
05-710-1E
Freezing medium for human iPSCs
Dispase
Gibco
17105-041
Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12
Sigma-Aldrich
D6421-500ML
Basal medium for cell culture
Doxycycline
Sigma-Aldrich
D9891-1G
Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U
WiCell
UWWC1-DS2U
Commercial human iPSC line
GDNF
PreproTech
450-10
Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line
Thermo Fisher Scientific
A18945
Commercial human iPSC line
Hepes
Sigma-Aldrich
H4034
Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin
Sigma-Aldrich
11243217001
Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA
Thermo Fisher Scientific
11140035
Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit
Thermo Fisher Scientific
MPK10096
Cell electroporation kit
Neon Transfection System
Thermo Fisher Scientific
MPK5000
Cell electroporation system
Neurobasal Medium
Thermo Fisher Scientific
21103049
Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).