Editing genico mediato da trasposone PiggyBac nelle iPSC umane: una procedura per integrare il gene di interesse nelle iPSC umane utilizzando il sistema di trasposoni PiggyBac

Iniziare con una sospensione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, hiPSC, in un tampone di elettroporazione adatto. Aggiungere una soluzione costituita da plasmidi codificanti la trasposasi PiggyBac e plasmidi donatori. Elettroporare la miscela.

Gli impulsi elettrici permeabilizzano transitoriamente le membrane cellulari, facilitando l'assorbimento cellulare dei plasmidi. I plasmidi donatori comprendono ripetizioni terminali invertite specifiche per trasposone, ITR, che sono complementi invertiti l'uno dell'altro, affiancati da ripetizioni TTAA che raggruppano la proteina bersaglio e i geni di resistenza agli antibiotici.

Le proteine della trasposasi PiggyBac espresse creano intaccature alle estremità 3' degli ITR, interne alle ripetizioni TTAA. I gruppi 3'-ossidrilici esposti attaccano il nucleotide del filamento complementare all'interno del DNA fiancheggiante, formando forcine TTAA sulle estremità del trasposone, rilasciando così il costrutto del trasposone dal plasmide.

Le traspose risolvono le forcine per formare sporgenze TTAA alle estremità 5' del costrutto del trasposone. Le trasposisi creano inoltre rotture a doppio filamento nella sequenza TTAA nel genoma ospite. Le estremità del trasposone 3'-ossidrile rilasciate attaccano la sequenza TTAA alle estremità sfalsate, provocando l'unione covalente del costrutto del trasposone al genoma ospite, lasciando spazi vuoti a singolo filamento che fiancheggiano il costrutto del trasposone. Queste lacune nel DNA dell'ospite vengono legate, portando a un'integrazione stabile del costrutto del trasposone.

Trattare le hiPSC seminate su una piastra rivestita di proteine della matrice extracellulare con terreni contenenti antibiotici. Il gene della resistenza agli antibiotici, guidato dal promotore a monte, consente la selezione di cellule geneticamente modificate.