Summary
Efter antigen exponering subpopulationer av aktiverade B-celler genomgå en process som kallas klass växla rekombination (CSR) för att producera antikroppar isotyper med distinkta effektorfunktioner. Det protokoll som beskrivs i denna rapport förklarar hur CSR kan induceras och analyseras
Abstract
Humorala immuniteten är den gren av immunsystemet upprätthålls av B-celler och förmedlade genom utsöndringen av antikroppar. Vid B-celler aktiveras genomgår immunglobulin lokus en serie av genetiska modifieringar för att ändra bindande kapacitet och effektor funktion utsöndras antikroppar. Denna process är markerad med en genomisk rekombination händelse kallas klass växla rekombination (CSR) som standard IgM-antikroppar isotyp ersätter en av IgG, IgA eller IgE. Varje isotyp besitter olika effektorfunktioner vilket gör CSR viktigt att upprätthålla immuniteten.
Diversifiering av immunglobulin locus medieras av enzymet aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID). En schematisk video som beskriver denna process i detalj finns på nätet (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID: s verksamhet och CSR-väg ofta studeras i bedömningen av B-cellernas funktion och humorala immuniteten hos möss. Det protokoll som beskrivs i denna rapport presenterar en metod för B-celler isolerade från murina mjälte och efterföljande stimulering med bakteriell lipopolysackarid (LPS) för att förmå klass byta till IgG3 (för andra antikroppar isotyper se tabell 1). Dessutom är den fluorescerande cellfärgning färg Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) används för att övervaka celldelning av stimulering av celler, en process avgörande för isotyp byta 1, 2.
Regleringen av AID och mekanism genom vilken CSR förekommer fortfarande är oklara och därmed in vitro klassen växla ge en tillförlitlig metod för att testa dessa processer i olika musmodeller. Dessa analyser har tidigare använts i samband med genen brist med knockoutmöss 3. Dessutom kan in vitro-byte av B-celler att föregås av viral transduktion att modulera genuttrycket RNA ÖVERVÄLDIGANDE eller transgenen uttryck 4-6. Uppgifterna från dessa typer av experiment har påverkat vår förståelse av AID aktivitet, upplösning av CSR reaktion och antikroppsmedierat immunitet i musen.
Protocol
Steg I: Isolering av mjälten B-celler genom magnetisk anrikning
- Experimentell möss bör vara i åldern 8-12 veckor för att säkerställa full mognad av immunsystemet.
- Euthanize musen genom halsdislokation och njuta i 70% etanol. Kirurgiskt ta bort mjälten genom att göra ett snitt genom huden och musklerna i vänster hypochondrium av buken och skär den i tre stora bitar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Se till att alla verktyg och reagens är sterila.
- Med hjälp av gummi slutet av en 1 ml spruta kolv, mjälte försiktigt mäsken genom ett 70 ìm cell sil i PBS. Var noga med att använda en driver rörelse snarare än en slipning rörelse som slipning kan leda till ruptur av större (det vill säga förökar) celler.
- Snurra ned cellerna till högst 350 g i 5 minuter och suspendera pelleten i PBS. Räkna återsuspenderade cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Bered en suspension av 1x10 8 celler / ml i PBS med 5% normal råtta serum i en steril 5 ml polystyren rör med ett lock (högsta volym på 2 ml per rör).
- Tillsätt 50 mikroliter av EasySep negativt urval Mus B-celler Anrikning cocktail för varje ml av celler. Pipettera blandningen, mössa rören, och ställ i kylen i 15 minuter.
- Tillsätt 100 mikroliter EasySep Biotin Val Cocktail för varje ml av celler. Pipettera blandningen, mössa rören, och ställ i kylen i 15 minuter.
- Tillsätt 100 mikroliter av EasySep magnetiska nanopartiklar (se nanopartiklar blandas väl och lösningen är homogen) för varje ml av celler. Pipettera blandningen, mössa rören, och ställ i kylen i 5 minuter.
- Top lösningen på 2,5 ml med PBS och placera i en EasySep magnet i 5 minuter. Vänd magneten och rör och häll snabbt in i en ny polystyren rör. Skaka inte röret som negativt markerade celler kommer att vara magnetiskt bunden till röret väggarna.
- För att ytterligare öka renheten av cellsuspensionen, kan röret sättas in igen i magnet för ytterligare 5 minuter och hälls i ett nytt rör. Detta kan minska de totala cell återhämtning.
- B-celler renhet kan bedömas genom flödescytometrisk analys av B-markörer på cellytan. Efter anrikning ser vi genomgående en renhet på> 95% B220 positiva celler.
Steg II: CFSE cellfärgning
- Resuspendera isolerade celler i varma PBS kompletterad med 0,1% bovint serumalbumin vid en slutlig koncentration av 1 x 10 6 celler per ml.
- Förbered en 5mm stamlösning av CFSE (utspätt i steril dimetylsulfoxid) och lägg 2μL för varje ml av celler i röret. Den slutliga koncentrationen av 10μM är optimalt för färgning av primära B-celler.
- Inkubera vid 37 ° C i 10 minuter i mörker (notera: CFSE är ljuskänsligt och bör förvaras i mörker när det är möjligt).
- Släck fläcken genom att lägga till en lika stor volym av nötkreatur kalvserum till dina celler och ruva på is i 5 minuter.
- Tvätta cellerna genom påfyllning rören med odlingssubstrat (se steg III för recept) och centrifugering vid 350 g. Observera att minst 5 gånger volymen motsvarande medier måste läggas för att motverka viskositet av nötkreatur kalvserum och för cellerna att producera en pellet.
- Tvätta cellerna två gånger mer i odlingsmedium. Cellerna är nu redo för stimulering.
Steg III: Cell stimulering med LPS
- Förbered er för in vitro-B cellodlingsmedium genom att komplettera RPMI 1640 med 10% fetalt kalvserum och 50 mikroM β-merkaptoetanol /.
- Förbered din stimulans medel genom att lägga till LPS i en slutlig koncentration av 50μg/mL. Alikvotera 125 mikroliter av stimulering mediet i varje brunn på en platt botten med 96 brunnar vävnadskultur plattan.
- Förbered din CFSE färgade B-celler i kultur medium utan LPS till en slutlig koncentration av 3,2 x 10 6 celler / ml. Tillsätt 125 mikroliter av cellsuspensionen till brunnarna med ditt stimulans medelstora och blanda genom att pipettera försiktigt.
- Varje brunn innehåller nu 4 x 10 5 celler i en slutlig LPS koncentration av 25 mikrogram / ml. Detta ger optimala nivåer av celltillväxt och klass växling, även om förändringar av dessa värden kan göras efter önskemål.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 72 till 96 timmar. Efter 48 timmar kommer kluster av stora förökar B-celler vara klart synliga i mikroskop.
Steg IV: flödescytometrianalyser av klass byta
- När du är redo att titta på klassen byta, ta bort dina celler från deras odlingsbetingelser och tvätta dem två gånger i 1 ml färgning buffert (PBS med 2% bovint kalvserum).
- För att förhindra icke-specifik antikropp färgning av dina celler, pellets cellerna genom att snurra dem vid 350 g och företagskuvöserTe dem i 100μL av färgning buffert med 5% vanlig mus serum och 1μg av FcBlock per106 celler i 15 minuter på is. Cell blockering skall utföras på is.
- Utan att tvätta dina celler, lägga 1μg per 10 6 celler i ett fluorescerande taggad anti mus IgG3 antikropp och låta cellerna att färga i 30 minuter på is.
- Tvätta cellerna två gånger genom centrifugering och återsuspendera i 200-300 mikroliter av färgning buffert. Cellerna är nu redo för bedömning av flödescytometri.
- CFSE är optimalt upphetsad vid 492 nm (genom en argon-jon-laser) och avger på 517 nm. Den excitation och emission spektrum av IgG3 antikroppen är beroende av dess konjugat fluorescerande färg.
Representativa resultat
Efter magnetisk anrikning bör cellsuspension ser ut som en homogen befolkning skilja små runda celler (Figur 1A). Efter 48-72 timmar av stimulering kommer isolerade grupper av förstorade celler som förökar sig vara väl synlig (Figur 1B). En stor del av den icke-celler som förökar visas små och korniga när de genomgår apoptos.
CSR kan normalt upptäckas på högsta nivå mellan 72 och 96 timmar efter stimulering innan de flesta av cellerna börjar dö 7. I detta skede bör cellerna har genomgått ett antal celldelningar med switchade celler som finns i de senare dottern cellpopulation. En representant flödescytometrisk tomt på CFSE utspädning och yta uttryck för IgG3 efter 96 timmar av LPS stimulering kan ses i figur 2.
Tabell 1. Isotyp byta cocktails. Obs: Stimulerande koncentration värden är endast rekommendationer. Titreringar kan vara nödvändig.
| Önskad isotyp | Stimulering Cocktail |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) och IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) och IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) och IFN-γ (10 ng / ml) |
| IgG2b och IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) och IL-5 (1,5 ng / ml) |
Figur 1. Isolering och LPS stimulering av mjältens B-celler. (A) magnetiskt berikat mjälten B-celler innan LPS stimulering. (B) 48 timmar efter stimulering med 25 mikrogram / ml LPS. Celler som förökar ses som kluster i en bakgrund av blästring och apoptotiska celler.
Figur 2. Spridning och klass växla rekombination efter 96 timmar. (A) CFSE utspädning för LPS stimuleras cellerna efter 96 timmar i kulturen. Varje oberoende topp motsvarar en utspädning i CFSE fluorescens motsvarande en självständig celldelning. (B) IgG3 uttryck visar framväxten av en IgG3 positiv befolkningsutveckling efter flera rundor av celldelning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan ger en standard test att bedöma statligt stöd uttryck och funktion under den klassen byte av primär murina B-celler. Detta protokoll använder bakteriella LPS att få byta från IgM till IgG3, även ändringar av stimulering media kan göras för att få byta till andra isotyper (sammanfattas i tabell 1 8, 9).
Vi har noterat att för ännu okända skäl kan fetalt kalvserum påverka nivån på klassen byter observerats in vitro. Det är avgörande att samma lotnummer användas för alla CSR experiment för att se experimentella konsistens. Det kan också vara bra att visa en panel av fetalt kalvserum källor för att uppnå optimal in vitro byter. Musstammar kan också påverka graden av klassen byter ses in vitro-10. Beroende på analysen i fråga, dåligt byte musmodeller, såsom SJL musen, måste vara tillräckligt backcrossed till C57BL / 6 bakgrunden för att nå märkbara byter.
Steg I kan utelämnas om en ren B cellkultur inte är önskvärd. Stimulering av en blandning av mjältens celler kommer fortfarande att framkalla klass växling, även om det kan resultera i en större population av apoptotiska icke-B-celler. Dessutom måste följande flödescytometrianalyser inkluderar en etablerad markör B-celler (t.ex. B220, CD19). Rening kit som används i detta protokoll levereras av StemCell Technologies (se reagenser tabell). Alternativa kit som använder en negativ process för anrikning kan också användas enligt tillverkarens anvisningar.
CFSE fluorescens kan vara mycket intensiv och därmed varje experiment kräver en lämplig ersättning kontroll för flödescytometrisk analys. Dessutom kommer CFSE läcker långsamt ut ur cellerna vilket resulterar i en minskning av de totala fluorescens över tiden. Av dessa skäl är det rekommenderat att alla experiment inkluderar en ostimulerade CFSE-färgad cell befolkningen. Under en kort tid kommer dessa celler är statiska i kultur och kan därför användas som en kompensation kontroll för CFSE och för att identifiera de icke-förökar cellpopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Martin laboratorium för hjälp diskussioner. Denna publikation stöds av ett stipendium från kanadensiska Institute of Health Research (MOP-89.783). AM stöds av en Canada Research Chair Tier II Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
