A seguito di esposizione agli antigeni, sottopopolazioni di cellule B attivate subire un processo noto come ricombinazione interruttore classe (CSR) per la produzione di anticorpi isotipi con distinte funzioni effettrici. Il protocollo descritto in questo rapporto spiega come la RSI può essere indotta e analizzati In vitro Al fine di studiare la funzione delle cellule B.
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Articolo metodologico
Induzione e Valutazione della ricombinazione Classe Switch in depurata cellule B murini
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunità umorale è il ramo del sistema immunitario mantenuto da parte delle cellule B e mediato attraverso la secrezione di anticorpi. Dopo l'attivazione delle cellule B, il locus immunoglobuline subisce una serie di modificazioni genetiche per alterare la capacità di legame e le funzioni effettrici degli anticorpi secreti. Questo processo è evidenziato da un evento di ricombinazione genomica noto come ricombinazione di classe switch (CSR) in cui viene sostituito il valore predefinito di anticorpi IgM isotipo per una delle IgG, IgA o IgE. Ogni isotipo possiede diverse funzioni effettrici rendendo in tal modo la RSI fondamentale per il mantenimento dell'immunità.
Diversificazione del locus immunoglobuline è mediato dalla attivazione degli enzimi deaminasi indotta citidina (AID). Un video che descrive schematicamente questo processo in dettaglio è disponibile online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Attività AID e la via della RSI sono comunemente studiate nella valutazione della funzione delle cellule B e immunità umorale nei topi. Il protocollo descritto in questo rapporto presenta un metodo di isolamento delle cellule B da milza murina e conseguente stimolazione con lipopolisaccaride batterico (LPS) per indurre il passaggio a classe IgG3 (per isotipi anticorpali altri vedi Tabella 1). Inoltre, la colorazione della cellula colorante fluorescente Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) è usato per controllare la divisione cellulare delle cellule stimolate, un processo cruciale per il passaggio isotipo 1, 2.
La regolamentazione degli aiuti e il meccanismo con cui la RSI si sono ancora poco chiari, e quindi test in classe interruttore in vitro forniscono un metodo affidabile per testare questi processi in diversi modelli murini. Questi test sono stati utilizzati in precedenza nel contesto di carenza di gene utilizzando topi knockout 3. Inoltre, in vitro il passaggio delle cellule B può essere preceduto da trasduzione virale di modulare l'espressione genica attraverso knockdown RNA o espressione del transgene 4-6. I dati da questi tipi di esperimenti hanno influenzato la nostra comprensione della attività AID, la risoluzione della reazione della RSI, e di anticorpi-mediata nel topo.
Protocollo
Fase I: isolamento delle cellule B della milza attraverso l'arricchimento magnetico
- Topi sperimentali devono essere di età compresa tra 8-12 settimane per garantire la piena maturazione del sistema immunitario.
- Euthanize il mouse dislocazione cervicale e immergersi in etanolo al 70%. Rimuovere chirurgicamente la milza facendo un'incisione attraverso la pelle ei muscoli del ipocondrio sinistro dell'addome e tagliata in tre pezzi grossi in tampone fosfato (PBS). Garantire tutti gli strumenti e reagenti sono sterili.
- Utilizzando la fine di gomma di una siringa da 1 ml stantuffo, poltiglia delicatamente la milza attraverso un filtro 70 micr....
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Discussione
Il protocollo di cui sopra fornisce un test standard per analizzare l'espressione AID e funzione durante la commutazione di classe delle primarie cellule B murini. Questo protocollo utilizza LPS batterici per indurre il passaggio da IgM a IgG3, anche se le modifiche ai mezzi di stimolazione può essere fatto per indurre il passaggio ad altri isotipi (riassunti nella Tabella 1 8, 9).
Abbiamo notato che, per ragioni ancora sconosciute, siero di vitello fetale possono influenzare .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati al laboratorio Martin per utili discussioni. Questa pubblicazione è sostenuta da una sovvenzione da parte del Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM è supportata da un Canada Research Chair Premio Tier II.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata al fosfato | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Kit EasySep per l'arricchimento di cellule B da topo | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Tubi in polistirene | BD Biosciences | 352058 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Kit per la proliferazione cellulare CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| Siero di vitello bovino | Hyclone | SH30072.03 | |
| Mezzo di coltura RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolisaccaridi da Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapto–etanolo | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30396.03 | |
| Siero normale di topo | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Anticorpo purificato da ratto anti-topo CD16/CD32 (Blocco Fc BD per topo) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anticorpo da ratto anti-topo IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
Riferimenti
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....
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Ristampe e permessi
