Il test sialidasi è un approccio semplice tecnica che chiarire romanzo meccanismo molecolare (s) di sensori TLR di infezioni microbiche e di coinvolgimento nelle malattie infiammatorie a livello dei recettori sulla superficie cellulare di macrofagi dal vivo.
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Articolo metodologico
Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l'attivazione del recettore
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mammiferi recettori Toll-like (TLR) sono una famiglia di recettori che riconoscono pattern molecolari patogeni associati. Non solo i sensori di TLR cruciale microbica (ad esempio, virus, batteri e parassiti) infezioni, hanno anche un ruolo importante nella fisiopatologia delle malattie infettive, malattie infiammatorie, e forse anche nelle malattie autoimmuni. Così, l'intensità e la durata delle risposte TLR contro le malattie infettive devono essere strettamente controllati. Ne consegue che la comprensione l'integrità strutturale dei recettori del sensore, le loro interazioni ligando e componenti segnalazione è essenziale per la successiva protezione immunologica. Sarebbe inoltre fornire importanti opportunità per la modifica delle malattie attraverso la manipolazione del sensore. Anche se le vie di segnalazione di sensori TLR sono ben caratterizzati, i parametri che controllano le interazioni tra i sensori e loro ligandi sono ancora poco definiti. Abbiamo recentemente identificato un nuovo meccanismo di attivazione TLR dal suo ligando naturale, che non è stato precedentemente osservato 1,2. Suggerisce che ligando indotta attivazione TLR è strettamente controllato dalla NEU1 attivazione sialidasi. Abbiamo anche riferito che NEU1 regola strettamente recettori neurotrofina come TrkA e TrkB 3, che coinvolgono NEU1 e la matrice metalloproteinasi-9 (MMP-9) cross-talk in complesso con i recettori 4. Il dosaggio sialidasi è stato inizialmente utilizzato per trovare un romanzo ligando, Timochinone, l'attivazione di Neu4 sialidasi sulla superficie cellulare di macrofagi, cellule dendritiche e le cellule di fibroblasti via GPCR proteine Gαi e MMP-9 5. Per i recettori TLR, i nostri dati indicano che NEU1 sialidasi è già in complessi con i recettori TLR-2, -3 e -4, ed è indotta su di legame a uno dei recettori. Attivato NEU1 idrolizza sialidasi sialyl α-2 ,3-legati residui distante da ligando β-galattosiltransferasi vincolante per rimuovere impedimento sterico di TLR-4 dimerizzazione, MyD88/TLR4 reclutamento complesso, l'attivazione NFkB e pro-infiammatorie risposte delle cellule. In un rapporto collaborativo, sialidasi NEU1 è stato dimostrato che regolano la fagocitosi in macrofagi 6. Nel loro insieme, il saggio sialidasi ci ha fornito spunti potente per i meccanismi molecolari del ligando indotta da attivazione del recettore. Sebbene l'esatta relazione tra NEU1 sialidasi e l'attivazione di TLR, recettori Trk deve ancora essere completamente chiarito, che rappresenterebbe un nuovo approccio pionieristico o per percorsi di regolazione cellulare.
Protocollo
1. Resuscitare i macrofagi congelati
- Prima di risorgere cellule congelate dal freezer -80 ° C, si ha la necessità di preparare un terreno di coltura sterile filtrata utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 5 mg / mL di plasmocin. Plasmocin è una soluzione di antibiotico utilizzato nella nostra ricerca per eliminare e prevenire la contaminazione da micoplasma di colture cellulari.
- Per un flaconcino di cellule congelate, si aggiunge 4 mL, 1 mL del mezzo di coltura per un CM 25 2 pallone di coltura cellulare in una cappa sterile contenimento rischio biologico.
- Quando la....
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Discussione
Utilizzando il test di nuova concezione per rilevare l'attività sialidasi in cellule vive macrofagi 2, abbiamo utilizzato questa tecnologia per rilevare l'attività sialidasi in ligando indotta attività sialidasi in live BMC-2 cellule macrofagi in modo dose-dipendente e in live-2.4 DC cellule dendritiche , HEK-TLR4/MD2, HEK293, le cellule di adenocarcinoma mammario SP1, WT umana e 1140F01 e WG0544 tipo I fibroblasti sialidosi. Gli inibitori della neuraminidasi come il Tamiflu (oseltamivir fosfato) ha i.......
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Dichiarazioni
SRA e PJ contribuito in maniera uguale come primi autori.
Ringraziamenti
Supporto parziale da sovvenzioni a MRS è di scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), l'Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC, e la ricerca Garfield Kelly cardiovascolari e Fondo di sviluppo. SRA è un destinatario del Premio Regina di ricerca dell'Università e del Robert J. Wilson Fellowship. PJ è un destinatario del premio di Laurea della Regina e il Robert J. Wilson Fellowship. AG e SA sono i destinatari del premio di Laurea della Regina. SF è stato il destinatario della Borsa di Studio Ontario Laurea in Scienza e Tecnologia (OGSST). AG è il destinatario della Borsa di studio della Regina Franklin Bracken Graduat....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Siero fetale bovino | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Mezzo di montaggio fluorescente | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (fosfato di oseltamivir) | Hoffmann-La Roche AG |
Riferimenti
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
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Ristampe e permessi
