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Preparazione in anticipo di microiniezione:
- Zanzare alimentazione del sangue: per iniezione da Lunedi a alimentare femmine Mercoledì sul precedente Venerdì. Per iniettare Giovedi e Venerdì, le femmine si nutrono di Lunedi della stessa settimana.
- Preparare gli aghi quarzo utilizzando il programma 2 e tampone isotonica (vedi Materiali).
- "Posa tubo" per gli embrioni è la regolare fiala cultura Drosophila. Cotone idrofilo bagnato in fondo, con un disco di carta da filtro umida che lo ricopre.
- Preparare antiscivolo in plastica di copertura da attaccare a doppio lato del nastro ad una estremità. Tagliare il nastro per coprire scivolare in modo che termina al bordo del vetrino.
- Preparare l'olio per essiccamento.
- Preparare una capsula di Petri con tampone isotonica di trasferire embrioni per la cova.
Messa a punto di posa forzata:
- Raccogliere 6-10 sangue femmine alimentate con l'uso di un aspiratore e di trasferirli al flaconcino cultura Drosophila con cotone e carta da filtro bagnata con tampone isotonica.
- Le zanzare vengono poi rimessi in condizioni insectery al buio e ha permesso di deporre le uova per 1 ora e 15 min.
- Lasciate che gli adulti volare nella gabbia e rimuovere il disco filtro di carta con gli embrioni.
- Per allineare le uova, lo fanno nell'ambito di applicazione dissezione. Raccogliere grappoli di uova con un pennello fine (Sable, n. 0000) e trasferimento in una piazza preparato di carta Whatman 3MM imbevuto di tampone isotonica. Tenere la carta sempre bagnato. Non lasciate che le uova si essiccato. Rimuovere il exochorion con il pennello, aiuta a bastone meglio le uova al nastro.
- Utilizzando bene pinza n. 5 o un pennello fine, raccogliere gli embrioni grigio scuro e dispongono in linea sui quadrati di Whatman 3MM bagnato con tampone isotonica. Allineare 20-30 embrioni. Tutti gli embrioni devono essere nello stesso orientamento come l'iniezione deve essere al polo posteriore. L'estremità anteriore degli embrioni è leggermente più larga della posteriore. Poi, usando strisce di carta Whatman 3MM, asciugare il filtro in cui sono allineate le uova premendo duro su entrambi i lati della linea di uovo, non toccare le uova.
- Per trasferire le uova, invertire la diapositiva che contiene il nastro biadesivo (Medicina), e premere delicatamente contro le uova. L'estremità posteriore delle uova devono essere molto vicino al bordo del nastro biadesivo. L'umidità della carta è fondamentale per questo, se è troppo bagnato che non si attacchi. Faccio essiccazione degli embrioni dal secondo 5-10, ma il tempo di essiccazione dipende dalla umido e la temperatura in camera microiniezione.
- Essiccazione è di fondamentale importanza per le uova: po 'troppo e gli embrioni non si schiuderà. Senza DNA essiccazione non sta andando in embrione.
- Coprire embrioni essiccati con olio Halocarbon per prevenire l'essiccamento ulteriormente.
Microiniezione degli embrioni:
L'aspetto più importante di iniezione buona è la qualità dell'ago (vedi nota).
- Riempire un ago con la soluzione di DNA da iniettare utilizzando un microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Molto poco soliution iniezione è necessaria, da 1 a 2 ml.
- Collegare l'ago al Transjector Eppendorf, che controlla il tempo di iniezione e la pressione, così come la contropressione. Microiniezione viene eseguita utilizzando un microscopio con un palco in movimento (Leica) in x 10 ingrandimenti e micromanipolatore (Leica). Se necessario, una fase microscopio sollevato può essere preparata impilando vetrini da microscopio 4-5. Posizionare il vetrino porta la embrioni sul palco rialzato. Gli embrioni vengono iniettati con un angolo di 150 °; penetrazione dovrebbe essere al polo posteriore. Per l'iniezione, tengo l'ago fermo e spostare lo stadio del microscopio. Quando l'ago è nuovo, la punta è sigillato e si rompe di solito la prima iniezione. Ho sempre lavorato la pressione necessaria per espellere una piccola goccia di DNA in olio fra ogni iniezione.
- Ho impostato il tempo di iniezione di 0,2-0,9 sec e 1000 hPa quando l'ago è nuovo. Ho variare la pressione e tempo fino una piccola goccia si vede che esce dal l'ago nel petrolio. La contropressione deve essere impostato circa 100. Come la punta dell'ago viene consumato, la pressione di iniezione deve essere ridotta per mantenere il basso volume di iniezione (circa 300 hPa). Dopo questo, la punta dell'ago è troppo grande e sta uccidendo la maggior parte delle embrioni.
- Dopo l'iniezione, togliete l'olio con carta velina e coprire il vetrino con embrioni e posto nella scatola di Petri con tampone isotonica. Porre le capsule nella insectory e lasciarli lì fino a quando gli embrioni portello. Cominciano a schiudono dopo 2-6 giorni. Trasferire le larve di acqua distillata con il pizzico di cibo a terra di pesce.
Note
DNA per iniezione: soluzione di DNA plasmidi iniettabile è stato isolato utilizzando EndoFree kit plasmide.Costruire plasmide e mescolare Helper plasmide insieme in giusta concentrazione, precipitato con isopropanolo. Il pellet è stato lavato con etanolo al 70% prima di risospendere nel buffer di iniezione. Prima dell'iniezione, il DNA pulito utilizzando Millex-GV colonna.
Tampone Izotonic:
1,68 M NaCl - 88,3 ml
1,68 M NaCl - 2,9 m
1 M Hepes -10,7 ml
1,12 M CaCl 2-2,2 ml
dH 2 O - 896 ml | O | 5 M NaCl - 29,67 ml
1 M KCl - 4,87 ml
1 Hepes M - 10,7 ml
1,12 M CaCl 2-2,2 ml
dH 2 O - 952,56 ml |
Aggiustare a pH 7,2