Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

Sommario

Dimostreremo come studiare l'effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Abstract

Dimostreremo come studiare gli effetti funzionali di introdurre una mutazione puntiforme in un canale ionico. Studiamo proteina G-dipendenti di potassio dentro rettificazione (denominato GIRK) canali, che sono importanti per la regolazione della eccitabilità dei neuroni. Ci sono quattro diversi mammiferi subunità del canale GIRK (GIRK1-GIRK4) - ci concentriamo sulla GIRK2 perché forma un homotetramer. La stimolazione di diversi tipi di proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR), come il recettore muscarinico (M2R), porta all'attivazione di canali GIRK. L'alcool inoltre attiva direttamente canali GIRK. Mostreremo come mutare uno specifico amminoacido da cambiare una o più nucleotidi nel cDNA per il canale GIRK. Questa sequenza mutata cDNA sarà amplificato nei batteri, purificata, e la presenza della mutazione puntiforme sarà confermata dal sequenziamento del DNA. Il cDNA per i canali mutato e wild-type GIRK saranno trasfettate in cellule renali embrionali umane HEK293T coltivati ​​in vitro. Infine, whole-cell patch-clamp elettrofisiologia saranno utilizzati per studiare le correnti macroscopiche di potassio attraverso i canali ectopica espresso GIRK wild-type o mutato. In questo esperimento, esamineremo l'effetto di una mutazione L257W in GIRK2 canali di attivazione M2R-dipendente e l'alcol-dipendente.

Protocollo

1. Mutagenesi sito

Noi usiamo mammiferi plasmide di espressione pcDNA3.1 codifica di un cDNA per GIRK2 e introdurre una mutazione puntiforme utilizzando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II sito-kit mutagenesi, secondo le istruzioni del produttore.

Sequenza primer può essere facilmente generato usando in linea programma di progettazione fondo disponibile all'indirizzo:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Nota: uso standard Eppendorf provette da 1,5 ml al posto del BD 14 mL descritte nel protocollo. Tuttavia, l'uso di XL10-Gold ultracompetent E. coli pretrattati con β-mercaptoetanolo, 30s tempo shock termico e NZY ⁺ (o NZYM ⁺⁾ i media sono fondamentali per la mutagenesi di successo. Se possibile, ingegneria una mutazione ulteriore silenzioso che crea un nuovo sito di restrizione può essere conveniente per lo screening di colonie mutanti sotto.

2. Miniprep, sequenziamento del DNA e Maxiprep

2,1 Qiagen miniprep e sequenziamento.

Singole colonie batteriche vengono raccolte e coltivate in brodo LB con ampicillina (AMP). Seguiamo le istruzioni del produttore per la purificazione del cDNA. Un digest restrizione semplice può essere utilizzato confermare il successo della mutazione, se un sito di restrizione è incorporato nel punto 1. Automatizzato sequenziamento del DNA viene fatto fuori sede, ed è essenziale per confermare la presenza della mutazione in cDNA, così come di valutare se ci sono mutazioni indesiderate. Questo passaggio è molto importante. Noi sequenza l'intera sequenza codificante GIRK utilizzando promotore T7 avanti e indietro BGH primer di sequenziamento che fiancheggiano sito clonazione multiplo della pcDNA3.1 plasmide.

Nota: è importante controllare con attenzione la sequenza elettroferogramma sufficiente per assicurare la qualità dei dati di sequenziamento. Elettroferogramma di alta qualità è forte, non sovrapponibili, con picchi di rumore di fondo poco.

2,2 Qiagen maxiprep.

Seguiamo le istruzioni del produttore.

Nota: questo passaggio è incluso nei nostri esperimenti per migliorare la purezza del cDNA, che troviamo è importante per la trasfezione efficiente.

3. Cultura e Transfection delle cellule HEK293T

Tutti questi passaggi dovrebbe essere fatto in una cappa sterile coltura di tessuti.

3,1 Colture cellulari

Cellule HEK293T sono comodi da usare perché sono facili alla cultura (37 ° C, 5% CO ₂ umidificata incubatore), il tempo veloce della replica, ad alta efficienza di trasfezione e sono suscettibili di whole-cell patch-clamp elettrofisiologia. Cellule HEK293T esprimere SV40 antigene T grande che assicura la replicazione del plasmide episomiale pcDNA3.1.

HEK293T cellule sono coltivate in condizioni di scarsa glucosio DMEM dei media integrato con L-glutamina e 10% siero bovino fetale (FBS). Per le celle passaging, aggiungere 0,25% tripsina / EDTA per confluenti (90-95%), le cellule HEK293T, attendere che le cellule si staccano dal tessuto piatto, quindi arrestare l'attività enzimatica con l'aggiunta di mezzi freschi contenente FBS /. Piastra ~ 1 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in un piatto ben 12 colture cellulari con 1 ml di antibiotico senza mezzi di coltura per bene. (1 x 10 ⁵ cellule è ~ 350 ml di sospensione cellulare ottenuta da confluenti T25 fiasco risospeso con 10 mezzi ml).

3,2 Transfection

Dopo 8-24 ore, le cellule HEK aderisce alla plastica e sono pronti per la trasfezione. Trasfezione delle cellule con 0,2 mcg canale cDNA, 0,4 mg M2R recettore cDNA e 0,04 mcg YFP cDNA utilizzando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: si usa una piccola quantità di YFP cDNA per determinare quali cellule sono transfettate con successo (le cellule verdi probabilmente contengono entrambi i canali GIRK e recettori M2). La concentrazione di cDNA da utilizzare dovranno essere regolati per ciascun clone.

3,3 visualizzazione fluorescenza delle cellule trasfettate.

Luogo 12-pozzetti sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza, ed esaminare le cellule per l'espressione YFP. Confronta con l'immagine DIC e prendere nota del numero approssimativo di cellule verdi. Questo fornisce una stima della efficienza di trasfezione.

3.4 Preparazione di ben 24 piatti e poli-D-lisina scivola copertina patinata

Pulire 12 millimetri scivola copertura in vetro (Warner, CS-12R) agitando per una notte con Radiacwash, seguita da lavaggio con acqua deionizzata e pernottamento agitazione in etanolo al 95%. Conservare il coprioggetto pulito nel 70% di etanolo fino al momento dell'uso.

Coperchio scivola posto in piastre di Petri con l'etanolo, fiamme al largo di etanolo con pinze e bruciatore, unluogo d in un pozzetto di una sterile 24 pozzetti.

Coprire ogni bene con 250 microlitri di poli-D-lisina (PDL), soluzione [0,2 mg / ml] e lasciare che il coprioggetto sedersi durante la notte immerso in una soluzione PDL sotto cappa sterile. Avvolgere il piatto ben 24 in Parafilm per evitare l'evaporazione.

La mattina dopo, aspirare PDL e lavare 2x con acqua sterile. Lasciare aperte le piastre ad asciugare sotto il cofano, poi coprire. I 24 piatti ben rivestiti con la polizza di copertura può essere avvolto in un foglio di alluminio sterile e conservato a temperatura ambiente per settimane.

3,5 cellule HEK293T Placcatura transfettate sulla copertina scivola

24 ore dopo la trasfezione delle cellule, suddivisi in ben 24 piatti (~ 4 X 10 ³ cellule / pozzetto) contenente copertura in vetro scivola rivestito con poli-D-lisina. Nota: le cellule transfettate può essere utilizzato fino a 24-72 ore dopo la trasfezione. Le cellule sono divise per fornire scivola copertura individuale per l'esperimento di patch clamp elettrofisiologia.

4. Elettrofisiologia

4,1 Soluzioni Preparazione

Extracellulare (bagno) soluzione: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl ₂ e 10 HEPES mM (pH 7.4 insieme con NaOH).

Aliquota 20K soluzione del bagno e aggiungere modulatori appropriato

• 20K + Ba ^{2 +:} soluzione contenente 1 mM BaCl _2: uno specifico inibitore di rettificare le correnti verso l'interno
• 20K + carbacolo: soluzione con mM carbacolo 5: un agonista M2R specifico; coppie M2R a G-proteine ​​che canali aperti GIRK
• 20K + Etanolo: soluzione bagno contenente 100 mM EtOH per attivare canali GIRK direttamente

Bagno di soluzioni luogo in siringhe (contenitori soluzione) del sistema rapido di perfusione a scambio. Nota: Usiamo un sistema pizzico Warner valvole per controllare le soluzioni bagno. Tubi in PE è raccomandato.

Interno / soluzione elettrodo: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl _2, 10 HEPES mM (pH 7,4) con 2,5 mM K ₂ ATP e 0,3 mM GTP Li _2.

Noi facciamo la soluzione elettrodo senza ATP e GTP. Noi a parte preparare aliquote di ATP e GTP, che sono conservati a -80 ° C, e aggiungere alla soluzione elettrodo, il giorno dell'esperimento. Manteniamo siringa con soluzione finale elettrodo sul ghiaccio per preservare la ATP / GTP. Noi filtro sterile (0,2 micron) le soluzioni interna / esterna per inibire la crescita microbica e ridurre la possibilità di intasamento dei tubi e l'elettrodo.

4,2 elettrodi Pulling

Utilizziamo Narishige due fasi estrattore verticale e elettrodo di vetro borosilicato da Warner strumento (1,5 mm di diametro esterno, 0,86 mm di diametro interno e 7,5 cm di lunghezza) per ottenere elettrodi con 3-7 MΩ di resistenza quando è riempita di soluzione intracellulare.

Nota: E 'necessario determinare sperimentalmente i parametri per l'estrattore elettrodo e il tipo di vetro dell'elettrodo nel vostro laboratorio. Per il nostro estrattore verticale, si usa una regolazione calore di 60,2 per il primo tiro e ~ 43 per la trazione secondo.

4,3 Whole-cell patch di bloccaggio

1. Montare il coperchio scivolare in un piatto da 35 millimetri con piccola quantità di vaselina, coprire con soluzione esterna e piatto posto sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza. Usa DIC di concentrarsi e trovare le celle, passare alla YFP fluorescenza per individuare YFP cellule positive.
2. Punta posizione di molteplici perfusione vicino a una cella verde (20-30 micron dalla cella di interesse = 2-3 lunghezza della cella a parte).
3. Riempire gli elettrodi con una soluzione, si attribuiscono alla headstage di amplificatore Axopatch 200B (Axon Instruments) con le seguenti impostazioni iniziali: Gain 1, Configurazione: intero a cellule β = 1, la modalità V-clamp.
4. Applicare una pressione positiva sul elettrodo per evitare l'intasamento della pipetta, e usare il manipolatore di inserire punta dell'elettrodo appena sopra la cella.
5. A zero il potenziale di pipetta, selezionare il pulsante di prova di tenuta per fornire un passo tensione di prova. I 5 step di tensione mV rettangolare appariranno nella finestra Sigillo Test di CLAMPEX. Regolare il potenziometro Pipettare Offset dell'amplificatore di portare la linea di base corrente a 0 nA. In alternativa, zero il potenziale di pipetta, disattivando la modalità amplificatore selettore V-track e la manopola metro per VTrack e utilizzare il potenziometro Pipettare Offset dell'amplificatore di portare la tensione sul display dello strumento amplificatore a "0,00".
6. Controllare la resistenza di elettrodo di comando utilizzando il test di tenuta del software 8,2 CLAMPEX (dovrebbe essere 3-7 MΩ).
7. Aprire un file di protocollo salvato o creare un nuovo protocollo. Per aprire file di protocollo selezionare dal menu principale Acquisire protocollo aperto e poi scegliere un file salvato protocollo di tensione. Per questo esperimento, il protocollo è stato creato per tenere potenziale di membrana a-40mV, fornire un unico punto di tensione 50 ms a -100 mV e rampa a +40 mV oltre 200 ms. Questo protocollo viene eseguito ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l'osservazione della rettifica inversione di potenziale e verso l'interno dei canali GIRK. Per tensione canali ionici, un passo di tensione rettangolare può essere più appropriato.
8. Cellula approccio con la regolazione fine del manipolatore, il rilascio a pressione positiva, dopo aver toccato la superficie della cellula applicare la pressione negativa, e monitorare aumento della resistenza nella finestra dell'oscilloscopio Sigillo di prova. Una volta che la resistenza è nel range GΩ, l'elettrodo ha sigillato sul membrana (Gigaseal si è formata).
9. Applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e accedere all'interno della cellula. Una volta nella cellula intera configurazione, si registrerà un aumento correnti capacitive.
10. Passa alla prova membrana in CLAMPEX e scrivere l'accesso resistenza Ra, la resistenza Rm membrana, Cm capacità di membrana e verificare ad occhio la misura esponenziale della curva teorica alla corrente reale capacitivo. Capacità della membrana è proporzionale alla dimensione della cella e saranno utilizzati successivamente per calcolare la densità di corrente.
11. Tornare alla prova di tenuta, insieme V-Out (potenziale di membrana) a -40 mV e filtro a 10 kHz
12. Compensare la capacità della membrana e la resistenza serie l'amplificatore con le seguenti operazioni:
    1. Accendere l'interruttore TUTTO PAC su CELL. Regolare PAC cellule intere, e compone RESISTENZA SERIE avanti e indietro, fino ad ottenere un impulso di piatto prova. Potrebbe anche essere necessario per regolare capacità VELOCE pipetta manopola PAC.
    2. Accendere la manopola% PREVISIONE a circa il 60-80%, ancora una volta ri-regolazione della PAC a cellule intere, e il quadrante resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione manopola VELOCE PAC pure).
    3. Accendere% COMP-al 100% senza oscillante della cella, cercando di mantenere le pulsazioni piatto di ri-regolazione della PAC cellula intera e resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione VELOCE manopola PAC pure). Regolare il ritardo riducendo il tempo costante.
    4. Annotare i valori di Cm (capacità di membrana), R (resistenza serie), COMP%,% PRED e tempo ritardo impostato sull'amplificatore nel notebook. La Cm e Rs dovrebbe essere all'incirca la stessa Cm e Rm misurata nel test a membrana di cui sopra.
13. Accendere valvola soluzione esterna per controllare la soluzione del bagno. Impostare l'amplificatore a 8 poli del filtro di Bessel per 2kHz, aprire un protocollo di tensione morsetto e iniziare la registrazione correnti.
14. Registriamo correnti GIRK utilizzando un protocollo rampa che passi a -100 mV per 50 ms poi rampe da 100 mV a +40 mV oltre 200 ms e viene consegnato ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l'osservazione del potenziale inversione e per raddrizzante verso l'interno dei canali GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), il GIRK attuale dovrebbe invertire vicino a -50 mV (con 20 mM KCl nella vasca da bagno), che si trova vicino al potenziale di equilibrio calcolato per K (E _K = -50 mV), quindi rimangono piuttosto piatto a potenziale positivo e _K.
15. Protocollo sperimentale: Dopo la registrazione di una linea di base stabile, passare alla soluzione 20K + carbacolo e attendere picco di risposta, tornare a 20K soluzione del bagno, quindi applicare 20K Etanolo + e attendere risposta di picco, quindi passare alla 20K soluzione del bagno e, infine, 20K + Ba ^{2 +} soluzione. Durante l'applicazione di questi farmaci si vedrà cambiamenti nella ampiezza di GIRK correnti (più pronunciata a -100 mV). Prendere nota del numero traccia corrispondente all'applicazione di diverse soluzioni extracellulari nel notebook. Un file Clampfit singolo conterrà tutti i spazza per l'intero esperimento.

5. Analisi dei dati

Utilizziamo Clampfit 9,2 software per analizzare i dati correnti GIRK a -100 mV.

1. Aprire il file con la registrazione, impostare il cursore a -100 mV. Per impostazione predefinita vedrete tutte le tracce sovrapposte sullo schermo. Premendo l'icona "Scrivi cursori" creerete Excel come foglio di calcolo con dati numerici.
2. Da X assegnando alla colonna numero di traccia e Y alla colonna di cursore e premendo l'icona "Create Graph" si può rapidamente disegnare una volta portate trama dell'esperimento.
3. Calcolare la corrente basale sottraendo corrente in presenza di Ba ^{2 +} da correnti registrate in soluzione perfusione esterno da solo ("20K corrente" meno "20K + Ba ^{2 +} corrente"). Calcolare le correnti indotte sottraendo corrente basale a 20K dalle correnti attivati ​​("20K + carbacolo corrente" meno "20K corrente", "20K + etanolo corrente" meno "20K corrente"). Calcolare la densità di corrente (pA / pF) dividendo l'attuale capacità di membrana (leggere direttamente dall'amplificatore). Calcolare l'attivazione per cento dividendo correnti indotte dalle correnti basale e moltiplicando per 100.

6. Rappresentante Risultati

Dovreste essere in grado di registrare corrente da cellule trasfettate con wild-type canali. Per la misura GIRK canalid nella soluzione extracellulare contenente 20 mM K ⁺ (e 145 mM K ⁺ intracellulare) che deve presentare una forte correzione verso l'interno e un potenziale inversione di circa -50 mV, che è una proprietà essenziale di canali del potassio. La wild-type corrente aumenterà fortemente su carbacolo applicazione (3-5 volte maggiore rispetto alle attuali basale) e di rispondere in modo simile al etanolo 100 mm. Nota: la convenzione di segno per elettrofisiologia è che la corrente interna è negativa e la corrente verso l'esterno è positivo. Per la mutazione L257W nella tasca di legame alcool GIRK2, vedrete le risposte attenuato sia per carbacolo ed etanolo. Questo suggerisce che L257 è coinvolto in alcool e l'attivazione delle proteine ​​G di GIRK2 canali. Per ulteriori esempi dei risultati di GIRK2 mutagenesi, vedi recente pubblicazione da parte Aryal et al. ^1.

Figura 1. Finestra di Clampfit 8,0 mostra i dati per il file di wild-type di registrazione GIRK2. Pannello in alto a sinistra mostra sovrapposte spazza registrato in risposta ad un protocollo di rampa di tensione in presenza di differenti soluzioni esterne bah. Cursore 1 è posizionato a -100 mV. I valori del cursore vengono scritti nel foglio di calcolo (pannello destro). Inferiore del pannello a sinistra mostra la trama del numero spazzare contro, la corrente. Si noti l'aumento di corrente (deflessione verso il basso) con etanolo (EtOH) e carbacolo (CARB) e inibizione della corrente con Ba ^{2 +.}

Figura 2. Descrizioni finestra di Clampfit 8,0 file mostra dati per un mutante GIRK2-L257W registrazione. Sono come nella figura 1. Rilevare la perdita di carbacolo (CARB) l'attivazione e la riduzione delle EtOH-correnti indotte nei canali mutanti.

Discussione

Mutagenesi sito-diretta è un classico approccio per lo studio relazioni struttura-funzione dei canali ionici. Si basa sul presupposto che modificando un residuo critico del canale ionico si dovrebbe essere in grado di osservare i cambiamenti pronunciato nella funzione del canale. Al contrario, le mutazioni in molti non critici posizione può essere introdotta senza perturbazioni importanti per la funzione di canale. Tipicamente, il residuo in questione è prima mutato in alanina, un piccolo non polare aminoacido, seguita dalla mutazione di triptofano, il più grande di aminoacidi ^2. Se il residuo è importante per la funzione di canale, sia le mutazioni cambierà l'attività del canale. Se un residuo meno essenziale è mutato, gli effetti della mutazione, in particolare ad alanina sono spesso irrilevanti. Mutazioni triptofano hanno maggiori probabilità di causare cambiamenti a causa di impedimenti sterici legata alle dimensioni triptofano. Spesso, quando l'informazione strutturale è carente, mutazione sistematico alanina o triptofano all'interno di un frammento di canale (chiamato alanina o triptofano scansione) possono essere utilizzati per individuare residui di critica. E 'importante notare che i cloni multipli con mutazioni puntiformi diverse possono essere preparati in parallelo permettendo di analisi dei residui multipli all'interno di tempo relativamente breve. Di recente, strutture cristalline più dei canali si sono resi disponibili ^3,4,5. Essi possono essere utilizzati per proporre eventuale presenza di residui chiave per essere testati utilizzando l'approccio descritto in questo protocollo.

Misure su wild-type canale dovrebbe sempre accompagnare la misura di un canale mutante per servire come controllo positivo per garantire che gli esperimenti di trasfezione ed elettrofisiologiche sono state fatte correttamente. Mutazioni puntiformi può portare alla mancanza di una corrente funzionale, una simile corrente al regolamento wild-type o alterata dell'attività canale. La mancanza di corrente misurabile può essere dovuto al traffico improprio pieghevoli o alterato. In tal caso può essere utile per scoprire se il canale traffici correttamente alla superficie usando un test biotinilazione o immunofluorescenza contro tag extracellulare (senza permeabilizzazione cellulare) per distinguere tra non funzionali dei canali sulla membrana plasmatica e canali trattenuto all'interno della cellula . Infine, è consigliabile indagare non solo l'attività basale del canale, ma anche le conseguenze della mutazione sulla regolazione del canale. Diversi meccanismi di modulazione della funzione di canale potrebbe essere studiata in funzione del canale ionico di interesse, tra cui la regolamentazione da parte delle proteine ​​G, PIP2, ioni, concentrazione di ATP, fosforilazione (con tirosina, serina o treonina mutazione), ubiquitinazione o sumoilazione (utilizzando mutazione lisina) e apri canale diretto o bloccanti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Prodotti chimici	Sigma	Varia
Kit Mini Prep	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Idrobromuro di poli-D-lisina	BD Biosciences	CB40210	Si può utilizzare anche poli-L-lisina
Kit Maxi Prep	Qiagen	12263
Kit QuickChange XL II per mutagenesi mirata	Stratagene	200512-5
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-027
Coprioggetti ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Tubulatura capillare in vetro borosilicato – parete standard	Warner Instruments	G150-3
Microscopio invertito a fluorescenza	Leica	DMI3000 B
Elettrofisiologia	Nikon/ Leica/ Zeiss	Qualsiasi microscopio invertito DIC (Hoffmann) con fluorescenza
Amplificatore	Molecular Devices	Amplificatore Axon Axopatch 200B
Sistema di perfusione	Warner Instruments	VC-6 Perfusion MM-6
Digitizzatore	Molecular Devices	Digitizzatore Digidata 1320
Manipolatori	Sutter Instruments	Manipolatore: MP-85
Tiratore di elettrodi	Narishige	Tiratore verticale per elettrodi PC10
Tavolo di isolamento	Technical Manufacturing Corporation	Tavolo pneumatico