Summary
Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.
Abstract
El vívido mundo de los olores es reconocido por el sentido del olfato. El olfato de los ratones es mediada por un repertorio de alrededor de 1.200 receptores acoplados a proteínas G (GPCR) 1 que se postulan para unirse las moléculas volátiles de olor y la conversión de la señal extracelular en una señal intracelular mediante el acoplamiento con la proteína G Gαolf. La unión de los olores de los receptores se cree que siguen una regla combinatoria, es decir, un olor puede obligar a varios receptores y un receptor puede unirse olores varios en distintos grados 2. Señalización bioquímica, y ligando los estudios de unión han sido convenientemente llevado a cabo para la mayoría de los GPCRs utilizando células heterólogas. Sin embargo el uso de células heterólogas para el estudio de los receptores de olor, fue excluida por mucho tiempo ya que en la transfección no pudieron exportar a la superficie. Saito et al han demostrado receptores de membrana de una sola pasada de Transporte de proteínas (RTP) acompañantes de la familia muestran una mayor expresión en las neuronas olfativas sensoriales y actuar como acompañantes a los receptores de olor de tráfico a la superficie en células heterólogas, cuando co transfectadas juntos 3. Para llevar a cabo los análisis bioquímicos de los receptores con células heterólogas, primero hay que determinar si el receptor muestra la expresión de superficie sólida en la línea celular. Esto se puede probar por sobreexpresión de los receptores con el RTP1S acompañante seguido por tinción de células vivas para la etiqueta fluorescente el dominio extracelular o una etiqueta en el dominio extracelular de forma exclusiva. Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.
Protocol
1. Procedimiento:
El procedimiento consta de tres partes completadas en un tiempo total de 3 días: la transferencia de células, transfección y la inmunocitoquímica, un paso llevado a cabo al día. Transferencia y la transfección de células en los dos primeros días se llevó a cabo en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar.
Día 1: Traslado de las células HEK293T para el ensayo de la superficie de la expresión.
- Medio de transmisión (M10): Mezclar medio mínimo esencial suplementado con 10% (en volumen) de suero fetal bovino en condiciones estériles.
- Se cultivan las células a una confluencia deseado en una placa de cultivo de 100 mm, dependiendo del número de platos necesarios para configurar. Es importante para determinar la fracción de células que se transfieren para evitar las células cubierto o escasa: por ejemplo, de un 100% confluentes plato de 100 mm, se puede transferir de 3% a un plato de 35 mm para obtener aproximadamente el 30% de confluencia en el este último.
- Antes de la transferencia de células, en la cámara de flujo laminar estéril, capa de 22 X 22 mm se desliza con cubierta de vidrio estéril lisina poli D (1 mg / ml) y colocar una en cada placa de cultivo celular de 35 mm, con revestimiento hacia arriba para las células de revestimiento (Figura 1 ). Deje que la solución se seque durante 5 - 10 minutos. Durante este intervalo, la fuente de UV en la cámara de laminar puede ser activado para esterilizar el cubreobjetos, si lo desea. Poli D lisina ayuda a las células heterólogas se adhieren a la cubierta se desliza.
- Para la transferencia de células, aspirar a los medios de comunicación existentes en la placa de 100 mm, lave cuidadosamente la adición de 8 ml de PBS estéril, aspirar el PBS y trypsinize las células en 3 mL 0,05% de tripsina-EDTA, cuando las células se desprenden de la placa, bloque de reacción enzimática más la adición de 5 ml M10. Triturar las células y la transferencia de volumen requerido para un tubo cónico estéril, centrifugar a 200 g durante 5 minutos para que sedimenten las células. Aspirar a cabo sobrenadante que contiene tripsina-EDTA, dejando el pellet de células intactas. Para transferir las células a placas de 35 mm, añada 1 ml M10 para cada plato y triturar para disociar las células. Añadir 1 ml de las células se resuspendieron a cada plato. Las células se incuban durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2.
Figura 1. Coat 22 X 22 mm cubreobjetos de vidrio con poli-D de lisina y el lugar estucado por una cara en cada plato de 35 mm.
Día 2: La transfección de células HEK293T.
- 18-24 horas después de la transferencia, las células están listas para la transfección de los receptores a ensayar. El uso de los receptores y RTP1S clonado en el vector de expresión de mamíferos PCI, preparado a partir de cultivos bacterianos utilizando Qiagen Miniprep protocolo Kit se describe a continuación antes de las 4. Use receptores que son etiquetados con terminal N 20 aminoácidos de largo epítopo rodopsina para facilitar la inmunotinción.
- El uso de la construcción de 1000 ng receptor, 250 ng de RTP1S construir y 50 ng de proteína de fluorescencia verde cada transfección. Realizar la transfección utilizando Lipofectamine 2000, según manual del fabricante.
Día 3: La inmunocitoquímica para visualizar receptores de las células teñidas superficie.
- Antes de comenzar, prepare las manchas y soluciones de lavado y enfriamiento a 4 ° C. Tinción medio: medio esencial mínimo, 45 ml, suero fetal bovino, 5 ml; HEPES (1M), 500 l (concentración final 10 mM), azida de sodio (1,5 M), 500 l (concentración final 15 mM). Solución de lavado: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 ml (concentración final 10 mM), azida de sodio (1,5 M), 5 ml (concentración final 15 mM). Ambas soluciones pueden ser almacenadas a 4 º C para su reutilización. Preparar las soluciones de anticuerpos mediante la dilución de anticuerpos necesarios en el medio de tinción de 100 veces.
- Inicio inmunoquímica para la tinción de la superficie de los receptores de olor alrededor de 24 horas después de la transfección. Para realizar la tinción de células vivas, el trabajo experimental debe ser enfriado a 4 ° C: llenar un gran contenido de hielo y patrones de la superficie de hielo para que sea lo más uniforme posible, coloque una bandeja en el hielo y rociarlo con el 70% etanol. Cortar un trozo de parafina (más pequeño que la longitud de la bandeja) y colocar en la bandeja de etanol rociado, para obtener una superficie lisa. La transferencia de la cubierta de vidrio que contiene las células transfectadas se desliza sobre la parafina, de uno en uno, lado celda hacia arriba, usando unas pinzas. Cada capa de hoja de cubierta con 100 L solución fría tinción primaria, extrusión cuidadosamente una esquina de la hoja (Figura 2). Después de todas las capas de la cubierta se desliza con una solución de anticuerpos, la cubierta de la bandeja para evitar el secado de la solución en el aire. Llevar a cabo la incubación primaria durante 45-60 minutos.
- Después de la incubación primaria, de forma rápida transferencia de la cubierta se desliza a las placas de cultivo de 35 mm original, que contiene los medios de comunicación. Aspirar los medios de comunicación y agregar 2 ml de solución de lavado enfriado ligeramente desde el borde del plato para evitar la pérdida de las células de la hoja de la cubierta. Aspirar la solución de lavado y repetir dos veces para completar tres lavados. Al final del tercer lavado, no aspirar a la solución de lavado.
- Prepare anticuerpo secundario solutien los medios de tinción y la transferencia de la cubierta se desliza desde la solución de lavado a una capa de parafina recién colocada en la misma bandeja. Una vez más suave extrusión de 100 L de solución de anticuerpos a la capa de cada hoja de la cubierta, desde la esquina, como la incubación primaria. Llevar a cabo la incubación secundaria de 30 a 45 minutos y traslado de regreso a la solución de lavado de la vajilla original de 35 mm. Una vez más, lavar la cubierta se desliza tres veces como se describe.
- Aspirar la solución de lavado de último lavado y añadir 2 ml de paraformaldehído al 1% frío. Fijar las células en una solución fría paraformaldehído al 1%, en hielo durante 15 minutos.
- Monte la cubierta se desliza sobre el cristal de microscopio limpio diapositivas con montaje Mowiol reactivo, con la cara de la celda hacia abajo y con cautela excluir todas las burbujas de aire (Figura 3). Deje secar al aire una vez Mowiol, lavar la cubierta se desliza suavemente por la adición de agua destilada en la superficie y aspirar de inmediato.
Figura 2. Capa de cada cubreobjetos con 100 L solución fría tinción primaria.
Figura 3. Montar el cubreobjetos con la cara hacia abajo en la celda de cristal de microscopio limpios diapositivas usando el reactivo de montaje Mowiol.
2. Los resultados representativos:
Tinción de células vivas le permite a uno visualizar las proteínas en la superficie de las células, en la transfección de los receptores con los acompañantes (en este caso de los receptores odoríferos Olfr62, con RTP1S receptor de proteína transportadora) (Figura 4). Tinción de la superficie celular de los receptores se caracteriza por el patrón de tinción puntiforme (Figura 4B, el recuadro). Tinción realizado inadecuadamente puede conducir a un mayor ruido, lo que hace difícil para el observador para distinguir las manchas de la superficie real del ruido. 
Transfección Figura 4. De los receptores con chaperones permite la visualización de proteínas en la superficie de las células mediante la tinción de células vivas. Transfección del receptor odorante Olfr62 solo (A) y la transfección de Olfr62 con acompañante RTP1S (B). Los niveles de expresión de GFP servir como control de transfección (A 'y B').
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Discussion
Cada paso debe ser realizado cuidadosamente para asegurarse de tinción de la superficie importante y distintivo. El proceso de tinción completa debe ser llevado a cabo en frío (sobre hielo), y la bandeja en la que se establecen cubreobjetos debe ser enfriado antes de su uso para asegurar las células sobrevivir. Por otra parte la fijación se realiza al final del proceso de tinción de la superficie. Esto está en agudo contraste con la tinción de interior en el que precede a la fijación de tinción para permeabilizar las membranas celulares de anticuerpos primarios y secundarios. Tiempo de exposición de la cubierta se desliza al aire deben reducirse al mínimo para evitar que las células se sequen, por lo que la estratificación de la cubierta se desliza con las soluciones de anticuerpos, la transferencia de la cubierta se desliza a la solución de lavado, cambio de solución de lavado entre los mismos debe hacerse de forma rápida y uno a la vez el manejo de hojas múltiples cubierta.
Dependiendo de la etiqueta de epítopo y los anticuerpos que se utilice, una vez tengas que ajustar el tiempo de incubación, el número de lavados, y doble de la dilución de anticuerpos. El ruido de fondo puede ser evitado mediante la dilución de los anticuerpos más o aumentar el número de lavados, o acortando el tiempo de incubación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros de Matsunami de laboratorio para la lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
