Articolo metodologico

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

36.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/2439

⸱

15 febbraio 2011

 ,  ,  , 
1Swedish Medical Nanoscience Center, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La procedura di fette preparazione contenente l'adulto del mouse nucleo ipotalamico soprachiasmatico (SCN), e un modo rapido per la cultura del tessuto SCN in condizioni cultura organotipica, sono segnalati. Inoltre, la misurazione della oscillatorio espressione della proteina del gene orologio utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista è descritto.

Abstract

Una centrale circadiano (~ 24 ore) orologio coordinamento ritmi quotidiani in fisiologia e del comportamento risiede nel nucleo soprachiasmatico (SCN) che si trova nell'ipotalamo anteriore. L'orologio è sincronizzato direttamente dalla luce attraverso la retina e del nervo ottico. Oscillazioni circadiani sono generati attraverso l'interazione feedback negativo di una serie di cosiddetti "geni dell'orologio" ei loro prodotti proteici, compreso il periodo (al) geni. Il clock del core dipende anche dalla depolarizzazione della membrana, di calcio e campo 1. Il SCN mostra oscillazioni giornaliere di espressione del gene orologio, l'attività metabolica e attività elettrica spontanea. Sorprendentemente, questa attività ciclica endogena persiste a fette tessuto adulto del SCN 2-4. In questo modo, l'orologio biologico possono essere facilmente studiate in vitro, permettendo indagini molecolari, elettrofisiologici e metabolici della funzione di pacemaker.

Il SCN è una piccola struttura ben definita bilaterale trova proprio sopra il chiasma ottico 5. Nel ratto contiene ~ 8,000 neuroni in ogni nucleo e ha dimensioni di circa 947 micron (lunghezza, asse rostrocaudal) x 424 micron (larghezza) x 390 micron (altezza) 6. A sezionare il SCN è necessario tagliare una fetta cervello a livello del cervello dove il SCN può essere identificato. Qui, descriviamo la procedura di dissezione e taglio del SCN, che è simile per il mouse e il cervello di ratto. Inoltre, ci mostra come la cultura del tessuto sezionato organotypically su una membrana 7, una tecnica sviluppata per la cultura SCN tessuto da Yamazaki et al. 8. Infine, abbiamo dimostrato come il tessuto transgenici possono essere usati per misurare l'espressione dei geni orologio / proteine ​​utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista, un metodo che in origine era usato per le misurazioni circadiano da Geusz et al. 9. Noi qui utilizzare tessuti SCN dal transgenico knock-in PERIOD2:: topi luciferasi prodotto da Yoo et al 10.. I topi contengono una proteina di fusione del PERIODO (PER) 2 e l'enzima luciferasi lucciola. Quando PER2 si traduce nella presenza del supporto per la luciferasi, cioè luciferina, l'espressione PER2 può essere monitorato come bioluminescenza quando luciferasi catalizza l'ossidazione della luciferina. Il numero di fotoni emessi è correlato positivamente alla quantità di proteina prodotta PER2, ei ritmi bioluminescenza corrispondere al ritmo PER2 proteina in vivo 10. In questo modo la variazione ciclica nell'espressione PER2 può essere continuamente monitorato in tempo reale durante molti giorni. Il protocollo che seguiamo per la coltura dei tessuti e la registrazione in tempo reale bioluminescenza è stato accuratamente descritto da Yamazaki e Takahashi 11.

Protocollo

1. Soluzione di preparazione

  1. Terreno di coltura di aria capacità tampone
    1. Riempire una bottiglia da 1 litro, con circa 800 ml sterile H 2 O (in autoclave MilliQ H 2 O).
    2. Mescolando, aggiungere e mescolare seguenti sostanze: 1 glucosio contenitore, privo di siero in polvere 2902 DMEM senza bicarbonato di sodio e rosso fenolo (rosso fenolo interferisce con il segnale di bioluminescenza), 20 mL B27 supplemento 50x, 4,7 ml di un 7,5% NaHCO 3 soluzione (o 0,35 g di NaHCO 3), 10 HEPES ml 1M, 2,5 ml PenStrep 10.000 U / mL e 3,5 g di D-glucosio. Lasciate che i media mescolare fino a quando gli ingredienti sono completamente sciolti.
      La media finale (1 litro) conterrà:
      DMEM 1x, 1x B27 supplemento, 4,2 mM NaHCO 3, 10 HEPES mm, 25 U / mL di penicillina, 25 U / mL di streptomicina e 19 mM D-glucosio.
    3. Regolare il pH a 7,2, usando NaOH HCl per diminuire o aumentare il pH, e portare il volume fino a 1 litro con sterili H 2 O.
    4. Regolare osmolalità con H 2 O (osmolalità diminuzione) o D-glucosio (osmolalità aumento). L'osmolalità deve essere compresa tra 285-315 mOsm / Kg, ma il range ottimale è 300-310 mOsm / Kg. Non per diluire il medium più del 5%.
    5. Filtrare il brodo di coltura sterile utilizzando Corning set di filtrazione sotto vuoto (ad esempio 2 x 500 ml con dimensione dei pori 0,22 micron) in una cappa sterile. Mantenere il mezzo in 4 ° C e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Si raccomanda che il mezzo venga utilizzato entro 3 mesi.
  2. Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) buffer con i supplementi (per le sezioni di taglio)
    1. Riempire una bottiglia da 1 litro in vetro con ~ 600 mL sterili (autoclavato MilliQ) H 2 O e aggiungere le seguenti sostanze: 100 ml di brodo HBSS 10x, 10 ml di penicillina-streptomicina 10.000 U / mL, 5 mL di un 7,5% NaHCO 3 soluzione e 10 ml HEPES 1M.
      La soluzione di taglio finale conterrà:
      1x HBSS, 10 HEPES mM, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml penicillina e 100 U / mL di streptomicina.
    2. Controllare il pH e, se necessario, aggiustare il pH a 7.2 e portare il volume fino a 1 litro con sterili H 2 O.
    3. Controllare osmolalità, che deve essere compreso tra 285-315 mOsm / Kg.
    4. Raffreddare la HBSS a 4 ° C. Il buffer HBSS deve essere molto freddo (4 ° C) durante le operazioni di affettamento / taglio procedura al fine di abbattere il metabolismo e preservare la vitalità dei tessuti.

2. Preparativi Prima di fette di taglio e coltura

  1. I tessuti sono coltivate in una camera calda e asciutta, senza CO 2. Per evitare di seccare la cultura devono essere sigillati con gli occhiali di accompagnamento allegata al piatti di grasso. A tal fine, compilare 5 siringhe mL con silicone a base di grasso per vuoto. Coprire le punte siringa con piccoli pezzi di carta stagnola e autoclave loro. Inoltre, autoclave filtro carta (usato durante taglio procedura).
  2. A destra prima di tagliare procedura, applicare grasso in autoclave a vuoto sulla superficie anello superiore di 35 millimetri piatti di Petri. Preparare un piatto a parte Petri per ogni cultura fetta.
  3. Prima di avviare procedura di affettare tutti gli strumenti non sterili, lame di rasoio, lame vibratome, vetri di copertura e altro materiale utilizzato per la procedura di fetta e la cultura devono essere sterilizzati. Spray tutti non sterili con il 70% di etanolo. Esporre gli strumenti e le piastre di Petri unta con UV in una cappa sterile per almeno 30 minuti di esposizione ai raggi UV prima coltura.
  4. Allo stesso tempo, riempire un tubo Falcon con l'aria-buffering terreno di coltura (conta 1,2 mL per ogni cultura; per 8 culture prepararsi per esempio, 10 ml di mezzo) e aggiungere appena scongelato luciferina (0,1 M soluzione madre, Promega, Madison, WI) (10 luciferina microlitri a 10 ml di mezzo; concentrazione finale di 0,1 mm).
  5. La luciferina è sensibile alla luce e sia soluzioni madre e la luciferina mezzo contenente bisogno di essere protetti dalla luce. Posizionare il tubo Falcon con luciferina-media in un buio 36-37 ° C il riscaldamento della camera. Se del caso, la luciferina possono anche essere aggiunti direttamente nei piatti cultura al momento del taglio. Se luciferina non viene aggiunto, non ci sarà nessuna reazione luce tra luciferasi e luciferina, e quindi nessun segnale dal tessuto.
  6. Dopo l'esposizione ai raggi UV, allegare una lama sterile al vibratome.

3. SCN Slicing procedura

La procedura seguente descrive taglio di adulto, di solito 2-4 mesi, C57/BL6 topi. Si prega di notare: la procedura di taglio, così come l'esposizione alla luce degli animali durante la notte, possono azzerare il differenziale fase del SCN. Per evitare questo, il taglio e la coltura deve essere effettuata durante le ore di luce, preferibilmente tra ZT 6-12, in assenza di sostanziali cambiamenti di fase a causa della procedura di verifica 12. Se SCN è da campionare nelle tenebre, 3.1 e 3.2 devono essere eseguite in luce rossa o con occhiali di notte per evitare la luce indotto spostamenti di fase.

  1. Anestetizzare il mouse preferibilmente con isofluorane (Baxter) in una GLAss da camera. Quando l'animale ha perso il suo dolore riflessi (controllo pizzicando con le unghie nella zampa), ma non ha ancora smesso di respirare (per mantenere la fornitura di ossigeno più a lungo possibile), rapidamente decapitare la testa con un paio di forbici o simili.
    Attenzione: in alcuni paesi CO 2 di esposizione (ipercapnia) è ancora consentito come metodo anestetico, anche se è stato segnalato per promuovere l'ansia animale. Inoltre, la dislocazione cervicale può essere richiesto prima di decapitazione. Si prega di seguire legislazioni locali quando eutanasia degli animali.
  2. Togliere gli occhi dalla testa con le forbici al fine di prevenire ulteriore tensione e l'eccitazione dei nervi ottici, che possono danneggiare il SCN.
  3. Se ancora attaccato, rimuovere il vertebrato ultimi cervicale con le forbici, togliere la pelle (Fig. 1a) e fare due tagli, con un bel paio di forbici (per esempio forbici iris), una tagliata su ogni lato del cranio lungo i lati, rendendo così removibile "coperchio".
  4. Aprire il cranio con uno strumento micro pinza ossivora (fine forbici dissezione può essere utilizzato anche su un mouse) e rimuovere tutte le ossa fino a quando il bulbo olfattivo può essere visto. Verso l'alto lavoro mai, premendo il cervello con lo strumento, al fine di evitare danni del SCN ventrale (Fig. 1b).
  5. Tagliare con cautela il nervo ottico tra i bulbi olfattivi ed emisferi utilizzando micro multa dissezione forbici primavera. Assicurarsi che il nervo sia completamente eliminati dal stiramento del nervo ottico può causare danni al SCN e fette di rottura.
  6. Girare la testa a testa in giù e lasciare che il cervello intatto cadere (se ancora attaccato al cervello, altri nervi cranici potrebbe essere necessario tagliare caudale del nervo ottico) in un contenitore (per esempio un piatto di vetro Petri ≈ 10 cm) riempito con 50-100 ml HBSS freddo che permette un rapido raffreddamento del cervello. Idealmente, i due nervi ottici dovrebbe rimanere intatto (Fig. 1c). Tenere il cervello in HBSS 30-60 secondi per assicurarsi che il cervello è raffreddato.
  7. Utilizzare un cucchiaio o simili e luogo del cervello refrigerati, superficie dorsale alto, su una superficie di taglio sterile (ad esempio un piatto di vetro Petri coperchio capovolto). Al fine di preparare un taglio coronale, fare un taglio perpendicolare con lame di rasoio sterile o bisturi tra gli emisferi cerebrali e il cervelletto, eliminando in tal modo il cervelletto.
  8. Applicare supercolla sulla piattaforma asciutta appartenenti alla vibroslicer / vibratome.
  9. Sollevare il cervello (emisferi cerebrali senza cervelletto e senza bulbi olfattivi) con l'inserimento di un forte, pinze curve nella parte rostrale e asciugare con cura le HBSS su una carta filtro sterile, sempre tenendo il cervello con le pinze. (Invece di inserire una pinza, un piccolo pezzo di carta da filtro sterile può essere utilizzato per collegare e trasferire il cervello).
  10. Fissare il emisferi sulla piattaforma incollato con la punta verso l'alto rostrale e la superficie ventrale più vicina alla lama di taglio. Fissare la piattaforma nel supporto appartenenti alla vibratome (per esempio da Campden Instruments, UK) e subito si riempiono di HBSS freddo. Se il taglio perpendicolare è fatto correttamente, il emisferi dovrebbe stare verso l'alto offrendo così un buon angolo necessario per fare un taglio coronale contenente il SCN bilaterali.
  11. Al fine di raggiungere la zona SCN bersaglio, inizia tagliando sezioni più spesse (500-800 micron) degli emisferi ad alta velocità o al massimo del vibratome. Spostando la lama può essere abbastanza veloce all'inizio prima di raggiungere l'ipotalamo, ma deve essere rallentato quando il chiasma ottico diventa visibile (ad alta frequenza della lama vibrante e lento movimento orizzontale diminuisce i danni delle cellule durante il taglio, aumentando così la vitalità fetta). Ridurre le sezioni da 100 micron quando il chiasma ottico diventa più grande (più ampio) e la commissura anteriore diventa più piccolo. Al fine di acquisire un mid-SCN sezione lavoro da soli "giù" (direzione caudale) fino a quando i due nuclei SCN iniziano a comparire. Una lente di ingrandimento può essere necessario per visualizzare i nuclei. Attenzione: il SCN nel cervello del mouse si trova più caudale del chiasma ottico rispetto al cervello di ratto.
  12. Quando il livello desiderato di SCN è stato raggiunto (il SCN sarà a questo punto appaiono come più definito, le strutture a forma rotonda o mandorla; Fig. 1d, circa bregma-0,46--0,70 mm per la regione centro di SCN nel topo 13, bregma - ,92--1,40 mm per ratto 14), tagliare la sezione SCN (Fig. 1e). Adeguato spessore della fetta è per il topo 250 ± 50 micron; per topo 350 ± 50 micron.
  13. Con una spazzola morbida, sollevare e trasferire la fetta SCN di un coperchio da un piatto di medie dimensioni Petri riempite con HBSS freddo, posta sotto un microscopio dissezione o stereoscopio. Controllare sotto ingrandimento se il SCN bilaterale è chiaramente visibile. Se la metà del territorio del SCN saranno scelti (che non necessariamente l'unico livello "ottimale" fetta, ma che riteniamo sia il modo più semplice per standardizzare la procedura di affettamento e ridurre le variazioni), deve essere chiaramente visto almeno su un lato delsezione. Se il taglio è stato troppo rostrale, fare un'altra sezione e controllare il SCN sotto ingrandimento.

4. SCN Cultura organotipica

  1. Nel coperchio capsula di Petri riempite con HBSS, sezionare il SCN bilaterali come un tessuto quadrato (~ 1,5 millimetri per lato) con un paio di bisturi sterili sotto un microscopio da dissezione. Un piccolo pezzo del chiasma ottico rimane attaccato al espianto, ma non altri nuclei dovrebbero essere inclusi. Tagliare il più vicino possibile senza rimuovere il tessuto SCN.
  2. Se del caso per l'esperimento previsto, il SCN bilaterali possono poi essere tagliati a metà per ottenere due SCN unilaterale. Un SCN unilaterale può essere quindi utilizzato come controllo (Fig. 2a).
  3. Riempire 1200 microlitri della luciferina-medio in un piatto ≈ 35 millimetri Petri e il luogo di una membrana cultura (Milli-CM 0,4 micron, Millipore, Bedford, MA) in cima alla superficie liquida (2b). Il volume del terreno di coltura è fondamentale, come la membrana cultura dovrebbe sedersi in modo sicuro alla base del piatto cultura, non galleggiare o roccia nel mezzo 11. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria sotto la membrana. Evitare l'esposizione non necessaria alla luce quando si lavora con luciferina.
  4. Il espianti sono piccoli e difficili da raccogliere. Quindi usare un 1000 + pipetta microlitri punta a succhiare l'espianto SCN nella punta e premerlo sulla membrana. Nel caso in cui espianto è troppo grande per adattarsi facilmente in una punta di 1000 ml pipetta (es. ratto SCN; e SCN del mouse bilaterali), la punta può essere tagliato con uno strumento sterile per creare un'apertura più ampia. Scartare HBSS eccessiva sulla membrana con la pipetta. Per la registrazione luciferasi, inserire una sola SCN / piatto (Figura 2b), come i tubi di registrazione rilevare tutti i fotoni emessi dal piatto e non distinguono tra i segnali provenienti da diversi tessuti.
  5. Sigillare il piatto con un bicchiere di copertura (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Germania) e grasso per vuoto (Dow Corning Corporation, USA) 11. Assicurarsi che il sigillo è stretta (Fig. 2c). In caso contrario, sigillare con più grasso.
  6. Trasferire le piastre a 36-37 A ° C a tenuta di luce della camera e iniziare PMT-registrazioni immediatamente.

5. Misurazione di attività luciferasi da bioluminescenza di registrazione

Luciferasi segnali bioluminescenza indotta dal tessuto SCN piccoli vengono rilevati e amplificati con photonmultiplier-tube (PMT) assemblee rilevatore montato all'interno di una camera di luce stretto. I PMT sono normalmente posizionati ~ 1-2 cm sopra i piatti della cultura 8. Impostazioni di registrazione PMT può essere personalizzato o sono disponibili in commercio 11.

  1. Porre la capsula con un PMT (il calore prodotto dal PMT rimuoverà condensa sul vetro di copertura) e chiudere la camera. Assicurarsi che la camera è al 100% a tenuta di luce come il numero oscuro della PMT utilizzato per tessuti SCN è molto bassa (meno di 20 fotoni / min). La PMT rilevare anche la dispersione di luce più deboli.
  2. Avviare l'acquisizione dati, che viene effettuata con il software (per esempio LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA). Conta fotoni sono integrati su intervalli 1-10 min per ottenere alta risoluzione del gene / proteina espressione.
  3. Dopo la registrazione è finita, l'espressione ottenuta circadiano del gene / proteina possono essere analizzati con il software appropriato (Origine, OriginLab, Northampton, MA, USA; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Crono, Till Roenneberg, Università di Monaco di Baviera, Monaco, Germania) per determinare fase, periodo (tempo per un ciclo) e l'ampiezza del ritmo. L'espressione di punta del gene o della proteina è in gran parte utilizzato come punto di riferimento ed è definito come il più alto numero di fotoni durante un ciclo. I dati possono essere smussati prima analisi di fase, periodo e ampiezza, soprattutto se il rapporto segnale / rumore è basso. La linea di base a volte modifiche e devono essere sottratto prima le analisi vengono eseguite.

6. Rappresentante dei risultati:

Noi qui presenti il ​​PER2 oscillatorio:: LUC espressione come leggere per la vitalità e la condizione del tessuto coltura. In condizioni ottimali, e se il tessuto è vivo, il PER2:: LUC espressione oscilla con un ritmo circadiano, come illustrato in figura 3. PER2 nel SCN è massimamente espresso tipicamente intorno Tempo zeitgeber 12-13 (dove ZT 12 rappresenta luci spente in un hr 12:12 luce: buio ciclo). Le dimensioni più grandi del tessuto vivo è, maggiore è il numero di fotoni diventa. Tuttavia, la dimensione e lo spessore del tessuto organotypically colta dovrebbe essere tenuto piccolo in modo da mantenere i tessuti vitali, preferibilmente non superiore a 15 mm 2 11 e non più spesse di 500 micron 7. Il SCN, se sezionato come descritto qui, mostra tipicamente conta fotone tra 10.000-40.000/min se il tessuto viene campionata da un omozigote PER2:: LUC animale. L'ampiezza dell'oscillazione nelle culture SCN organotipica è in genere molto elevato durante il primo ciclo in confronto con i cicli successivi. Non è del tutto chiaro perché il primo ciclo ha amplit molto altaUde. Una possibile spiegazione è che una parte sostanziale delle cellule nel tessuto può morire poco dopo il taglio iniziale e coltura, quindi non utilizzando luciferina dopo il primo ciclo. La procedura di taglio può anche causare eccitazione eccessiva che potrebbe amplificare il segnale luciferasi durante il primo ciclo.

La figura 3 mostra le tracce luminescenza da fette di SCN e contiene una traccia (rosso) ottenuto da una fetta che non era inizialmente sana. Tessuti morti o insalubri sono linee di base a basso numero di fotoni. (In aggiunta, i tessuti morti spesso si dissociano nel piatto e non può essere rimosso dalla membrana in un unico pezzo).

La tecnica descritta in questo rapporto può vantaggiosamente essere utilizzato negli esperimenti farmacologici. La Figura 4 mostra una traccia da una cultura che abbiamo trattato tra il giorno 1 e 2 con un bloccante dei canali HCN (ZD7288, 10 mM). Come si può vedere nella figura e come pubblicato in precedenza 15, il blocco ha ridotto significativamente l'ampiezza dell'oscillazione circadiana del PER2, tuttavia, dopo il lavaggio con terreno di coltura normale l'oscillazione è tornato, a dimostrazione che il blocco colpito l'orologio molecolare, ma il tessuto è stato vitale e sano.

Figura 1
Figura 1. Affettare procedura
A) La testa di un topo eutanasia decapitato con gli occhi e la pelle rimossa. B) Il cranio è stato rimosso con uno strumento di micro pinza ossivora. Quando si utilizza lo strumento, è necessario lavorare verso l'alto e mai premere il cervello con lo strumento. C) Il cervello mostrato a testa in giù (fino lato ventrale) senza bulbi olfattivi. Il chiasma ottico bianca con i due nervi ottici intatto può essere visto. Il nucleo soprachiasmatico (SCN, i confini segnati in rosso) si trova nei pressi del chiasma ottico. D) Un cervello coronale taglio solidale alla piattaforma nel vibroslicer, a livello di SCN. E) sezione coronale del cervello (250 micron di spessore) contenente il chiasma ottico (OC), terzo ventricolo (3V) ed i nuclei bilaterali soprachiasmatico (SCN).

Figura 2
Figura 2. Tessuto coltura organotipica.
A) I due nuclei SCN unilaterale (inserto) sezionato dalla fetta mostrato. B) piatto Cultura (35 mm Petri) con membrana cultura, media e espianto, ma senza grasso per vuoto e il vetro di copertura. Il mezzo (1,2 ml) può essere visto come liquido tra il piatto e la membrana. Un nucleo SCN unilaterale è posto sulla membrana cultura. Il bianco più parte del tessuto è un piccolo pezzo del chiasma ottico (inserto). C) Il piatto cultura con la sua membrana e il suo tessuto SCN, sigillato con grasso per vuoto e un bicchiere di copertura rotondo.

Figura 3
Figura 3. Registrazioni bioluminescenza da culture SCN sano e non sano del tessuto.
Esempi di registrazioni di bioluminescenza PERIOD2:: luciferasi (PER2:: LUC) espressione nel nucleo soprachiasmatico (SCN) fettine ottenute da topi tenuto in una 12h: 12h luce: buio ciclo. La PER2:: LUC proteine ​​oscilla con un ritmo circadiano (~ 24 ore), variazione, in cui la massima espressione della proteina si verifica in fase zeitgeber 12-13. Quindi, la fase del ritmo gene dipende dal programma chiaro scuro in cui è stato tenuto l'animale prima sacrificato. Tipicamente, la bioluminescenza dai tessuti SCN unilaterale sezionato come descritto nel protocollo mostra conta tra fotone ~ 10.000-40.000/minute. La figura mostra le tracce da un sano (nero) cultura SCN, una non sana cultura SCN (rosso) e una cultura che SCN asciugata (blu) dopo l'apertura il piatto sigillato cultura al giorno 4 e non ri-sigillare il piatto correttamente ( indicata dalla freccia).

Figura 4
Figura 4. Registrazione bioluminescenza durante e dopo l'esposizione al farmaco.
PER2:: LUC espressione in una cultura prima, durante e dopo l'azione di un bloccante dei canali HCN (ZD7288, 10 mM). La prima freccia indica il momento in cui il blocco è stato aggiunto. La seconda freccia indica washout, che è stato fatto sostituendo il farmaco contenente medio con mezzo di controllo condizionata. Si noti l'ampiezza ridotta dopo 2 giorni di esposizione al farmaco, la mancanza di oscillazione al giorno 4 e il recupero rapido del ritmo proteina dopo washout.

Discussione

Vantaggi e svantaggi della tecnologia giornalista luciferasi

In contrasto con ex metodi in vivo, come la RT-PCR, ibridazione in situ e Western blot che richiedono il campionamento dei tessuti in molti diversi momenti (per un periodo di bassa risoluzione di solito 2-4 ore a seconda della frequenza di campionamento) al fine di studiare diurno variazioni nelle espressioni dei geni e delle proteine, la tecnologia giornalista luciferasi permette ad alta risoluzione (1-10 min) studi di oscillazioni circadiane per molti giorni nella stessa preparazione. Gli studi in tal modo, il numero di animali utilizzati è ridotto al minimo e dettagliata degli effetti sulla fase e periodo del ritmo sono fattibili, che normalmente non è possibile utilizzando tecniche convenzionali di campionamento con risoluzione minimo storico. Tuttavia, anche se le misurazioni ampiezza relativa del ritmo sono possibili, va sottolineato che la tecnologia giornalista non è quantitativo e non può quindi essere utilizzato per misurare la quantità di geni trascritti o proteine ​​tradotte.

Le registrazioni dei tessuti può essere avviato e analizzati immediatamente dopo la coltura, un grande vantaggio per studiare direttamente gli effetti molecolari dello stress in vivo, in vivo indotta dalla luce sfasamenti ecc cultura SCN organotipica permette di lungo periodo (settimane) la manipolazione farmacologica del cervello adulto tessuto contenente un intatto rete maturo sinaptica e la tecnologia giornalista luciferasi permette registrazioni stabile per molte settimane. Così, il tessuto non ha bisogno di essere neonatale o postnatale precoce al fine di ottenere colture sane e, in contrasto con l'acuta fetta trattamenti farmacologici cronici possono essere eseguite. In contrasto con plasmide-reporter trasfezioni in colture cellulari, che non fanno portare alla incorporazione di DNA nel genoma, il transgenico-luciferasi modelli animali (così come Lenti-virus trasfezioni) sono favorevoli se alterazioni epigenetiche sono da studiare. Si deve in questo contesto inoltre ricordato che l'imaging luminescenza è oggi possibile con telecamere CCD ad alta sensibilità 11, permettendo registrazioni anche nei neuroni SCN singola (~ 6-10 micron) e di altri tipi cellulari, utilizzati dai grandi laboratori studiando i ritmi circadiani. Infine, alcuni investigatori circadiano usa comunemente il monitoraggio di espressione molecolare con altri giornalisti, come la proteina fluorescente verde, al fine di studiare geni orologio / oscillazioni proteine ​​16-19.

Aspetti di spessore della fetta

Gli spessori qui raccomandato della fetta SCN (200-300 micron) potrebbe essere ridotto o aumentato, se desiderato. Tuttavia, anche se il tessuto si appiattisce sulla membrana dopo alcuni giorni di cultura, non è consigliabile superare i 500 micron di spessore della fetta inizialmente tagliati al fine di preservare la vitalità del tessuto 7. Una fetta più sottile di 100 micron è di ragioni meccaniche e pratiche difficili da maneggiare. Perché il tessuto SCN è eterogeneo lo spessore della fetta può influenzare la fase del segnale di uscita luciferasi, dal momento che diverse regioni del SCN (ad esempio il "core" rispetto al "guscio", e delle regioni dorsali contro ventrale) oscillano con le diverse fasi 20 e differenziale re-sincronizzazione dopo sfasamenti 21. Lo spessore della fetta influisce anche sulla base del numero di fotoni da più tessuti emette un maggior numero di fotoni. L'ampiezza delle oscillazioni molecolari possono in questo modo indirettamente essere influenzata dalle dimensioni del l'espianto. Per queste ragioni, il controllo e colture trattate devono essere sempre delle stesse dimensioni, spessore e contenenti la stessa regione del SCN al fine di oscillare nella stessa fase e con la stessa ampiezza. I due nuclei unilaterale, invece, oscillano in fase tra loro e con ampiezze simili fino a quando il taglio vibratome è orizzontale e non inclinato (che a sua volta dipende dal taglio che la separazione tra il cervelletto e le due emisferi è perpendicolare per la superficie del tavolo). Un investigatore che esegue la coltura SCN possono verificare che le culture SCN non oscillano in fase tra loro. Praticare e standardizzazione della tecnica di taglio, cioè le fette sono sempre tagliati alla stessa rostro-caudale livello del SCN, migliorerà il risultato.

Passaggi critici

  1. Apporto di ossigeno è fondamentale.
    Perché il cervello richiede un sacco di ossigeno 22, la procedura di taglio deve essere veloce (il più vicino è quello di 3,1-3,10 ~ 5-6 minuti il meglio è in modo da mantenere il tessuto sano).
  2. Il SCN è sensibile alle variazioni di temperatura e lo scambio di media.
    Il SCN è sensibile alla temperatura e variazioni di temperatura possono grande sfasamento il pacemaker e causare artefatti sperimentali 23. Se media o soluzioni sono sostituiti o aggiunti durante un esperimento in corso, per esempio quando si applica un farmaco dopo un paio di giorni di cultura, i media o solution deve essere pre-riscaldato a 36-37 ° C (la stessa temperatura nella camera) prima di addizione. Negli esperimenti farmacologici che coinvolgono scambi di media, è importante lavorare sempre con la pre-condizione terreno di coltura cellulare. Inoltre / wash-out con fresco, mezzano incondizionato può potenzialmente sfasamento del ritmo molecolare SCN 24 nonché altre culture tipo di cellula 25.
  3. Composizione media.
    E 'importante la cultura del tessuto di pH corretto e osmolalità. L'aria-buffering terreno contiene una grande quantità di HEPES, che ha una capacità ottimale del buffer nel range di pH 6,8-8,2 ed è anche adatto per il buffering dei cambiamenti di pH che possono verificarsi a causa della respirazione cellulare. HEPES, invece, è più sensibile alle variazioni di temperatura rispetto al bicarbonato di sodio, che è incluso in piccole quantità nel terreno di coltura. Bicarbonato di sodio ha una maggiore capacità di tamponamento del pH più basso (5,1-7,1) Gamma 26, in tal modo appropriato in un CO 2 nell'atmosfera. Tuttavia, una maggiore quantità di bicarbonato di sodio in aria-buffering medium (DMEM 2902) aumenta la osmolalità modo significativo e non può essere aggiunto senza contemporaneamente diluire il mezzo, che a sua volta nella composizione errata di aminoacidi, vitamine e ioni.
    Consigli per la preparazione del mezzo:
    1. Essere preciso e attento durante la miscelazione del mezzo.
    2. Utilizzare soluzioni di riserva solo fresco o appena scongelato.
    3. In caso di osmolalità molto elevato non vale la pena di diluizione. Più di 5-6% di media-diluita molto probabilmente non funziona. Usare D-glucosio per aumentare osmolalità se è troppo bassa.
  4. Fase turni a causa di tempi di preparazione
    Il tempo di preparazione fetta è critica. Effetto nullo o minimo sui fase si ottiene se la procedura viene eseguita fetta tra ZT 6-12 dicembre. Tutte le dissezioni fetta devono essere effettuate presso la stessa fase del ciclo diurno o circadiano al fine di minimizzare l'errore dovuto alla variazione di fase tra i preparativi.

Eventuali modifiche

  1. Per elettrofisiologia SCN acuta, il taglio deve essere eseguito con una suoneria (Artificial liquido cerebrospinale; ACSF) tampone, satura di ossigeno (95% O 2, 5% CO 2) prima dell'inizio taglio. Inoltre, l'ossigeno è necessario aggiungere continuamente al buffer durante l'intera procedura taglio, in quanto l'attività elettrica e sinaptica è direttamente dipendente dalla fornitura di ossigeno 22.
  2. Fette orizzontale e sagittale può anche essere successo preparato e colto del SCN. Gli autori hanno esperienza con le registrazioni luciferasi a fette orizzontali, che secondo la nostra esperienza dare oscillazioni circadiano con minore ampiezza rispetto al taglio coronale.
  3. Il SCN è di circa 1 mm di lunghezza rostro-caudale e la tecnica di taglio qui descritto è indirizzati verso l'acquisizione di una sezione di SCN nella regione centrale. Tuttavia, più di una sezione SCN possono essere ottenute da topo e cervello dei topi, permettendo l'indagine del gene circadiano / espressione della proteina a livelli più rostrale rispetto caudale del nucleo SCN.
  4. Culture fetta da animali giovani, cuccioli o anche dopo la nascita degli embrioni, può anche essere preparati. Si prega di notare che il cervello e il cranio in cuccioli molto giovani sono molto morbidi e sensibili. Inoltre, il nervo ottico è sottile e non pienamente sviluppata. Fare attenzione quando sezionare il cervello dei cuccioli in modo che la regione SCN non sia danneggiato. Per esempio, i micro pinza ossivora strumenti non possono essere usati per aprire il cranio di cuccioli di topo, perché sono troppo grandi. Forbici sono sufficienti per tagliare i tessuti molli nei cuccioli giovani.
  5. Il vetro di copertura tecnica basata cultura qui descritto può essere utilizzato anche per luminescenza immagine usando un CCD / EM-CCD, anche nei neuroni SCN singolo.
  6. Altre regioni del sistema nervoso centrale e nei tessuti degli organi periferici da transgenici PER2:: LUC animali può essere facilmente ottenuto, colti e analizzati in termini di oscillazioni molecolari, come la PER2:: LUC espressione continua ad oscillare per molti giorni anche in diversi altri tessuti e tipi di cellule 10. La maggior parte di questi tessuti periferici, per il fegato esempio, non richiedono una membrana per la sopravvivenza, ma sono invece colti direttamente immerso nel mezzo 11. Si prega di notare che la fase di spostamento a causa di sezionamento, coltura e lo scambio di media non può seguire gli stessi principi di SCN.

Significato

In topi transgenici e ceppi di ratto (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) l'attività enzimatica luciferasi riflette proteina o ritmi espressione genica e può essere valutato mediante la registrazione bioluminescenza. La luciferasi generati bioluminescenza dà un segnale debole, ma la luminescenza di fondo è vicino a zero, rendendo questo metodo vantaggioso. Inoltre, poiché la molecola luciferasi è instabile e rapidamente degradata non c'è phototossicità, che possono comparire durante il lungo periodo di illuminazione eccitatori 28. Prese insieme, queste caratteristiche permettono di lunga durata esperimenti di rendere la tecnologia giornalista luciferasi altamente vantaggiosa in ricerca circadiano.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council svedese (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61x-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; le fondamenta della Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist e Sigurd och Elsa Goljes Minne e Società Svedese di Medicina SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, si ringrazia per preziosi commenti sul manoscritto. Ringraziamo il dottor Michael Andäng e la dottoressa Helena Johard per il bloccante dei canali HCN, e il Prof. Abdel El-Manira per la fornitura di microscopio video.

Considerazioni etiche:

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Karolinska Institutet e "Stoccolma Norra Djurförsöksetiska Nämnd". Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti con l'intento di ridurre al minimo ogni possibile stress o disagio per l'animale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Integratore B27 50xInvitrogen17504-044
Vetrini coprioggettoMenzel-Glaser40#1≈ 40 mm
Membrane per colturaEMD MilliporePICMORG500.4 μm
DMEM a basso contenuto di glucosio senza rosso fenoloSigma-AldrichD2902Polvere per 1L
Carta da filtroWhatman, GE Healthcare1003 055≈ 55 mm
Set di filtrazioneCorning431097Dimensione pori 0,22 μm polietersolfone
PinzetteAllgaier Instrumente0203-7-PSDumant n. 7
HEPESInvitrogen15630-056100 ml
HBSS 10xInvitrogen14065-049500 ml
NaOCH3 7,5%Invitrogen25080-06050 ml
LuciferinaPromega Corp.E1602Luciferina di coleottero, sale di potassio
Strumento micro rongeurAllgaier Instrumente332-097-140
PenStrep 10.000 U/mlInvitrogen15140-122100 ml
Piastre di PetriCorning430165≈ 35 mm
PMTHamamatsu Corp.H9319-11MOD
Lame chirurgiche monousoParagonP503Taglia 11
Filtro a vuotoFisher Scientific09-761-5
Grasso per vuotoDow Corning50 g
VibratomoCampden Instruments

Riferimenti

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
  2. Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
  3. Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
  4. Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
  5. Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
  6. Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  8. Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  9. Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
  10. Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  11. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  12. Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
  13. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
  15. O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  16. Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
  17. Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
  18. Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
  19. LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
  20. Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
  21. Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
  22. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
  23. Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
  24. Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
  25. Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
  26. Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
  27. Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
  28. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Coltura di tessuti organotipicapreparazione di sezioni cerebralitopi PER2 LUCIFERASEmisurazione della bioluminescenzaanalisi del ritmo circadianorilevamento tramite tubo fotomoltiplicatorecoltura di membrane tissutali

Articoli correlati