Summary
हम एक alternant चूहों में मॉडल उतारने hindlimb विकसित की है. हमारे hindlimb उतारने पारंपरिक मोरे Holton पूंछ कर्षण तकनीक पर पूंछ अंगूठी विधि का प्राथमिक लाभ यह है कि जानवर पर तनाव कम से कम एक सरल सरल प्रक्रिया है.
Abstract
मोरे Holton hindlimb उतराई विधि (एच यू) एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन (नासा) 4-6 कृन्तकों में अप्रचार शोष अध्ययन के लिए भूमि आधारित मॉडल है . हमारे अध्ययन से चूहों में सोने के मानक मोरे Holton HU तकनीक पूंछ कर्षण के लिए एक alternant विधि का मूल्यांकन किया. पचास चार मादा चूहों (08/04 मो.) 14 दिनों के लिए एच यू (n = 34) या 28 दिन (n = 20) थे. एच यू से वसूली एच यू (n = 22) निम्नलिखित 3 दिन सामान्य पिंजरे ambulation के बाद मूल्यांकन किया गया था. आयु मिलान चूहों (n = 76) वजन रखनेवाला नियंत्रण के रूप में सेवा की.
एच यू के लिए पहले 2-0 बाँझ शल्य कि 5 वें, 6 वें या 7 वें अंतर कशेरुका डिस्क स्थान के माध्यम से पारित किया गया था और जिसमें से चूहों को निलंबित कर दिया गया एक अंगूठी आकार में इस्पात तार के साथ एक पूंछ की अंगूठी गठन किया गया था. पूंछ अंगूठी के लिए कशेरुका स्थान के लिए उचित शौच के साथ हस्तक्षेप किए बिना पशु शरीर के वजन के संतुलन के लिए चुना गया था.
हम पहले और बाद में एच यू, soleus शोष की डिग्री, और अधिवृक्क जन निम्नलिखित एच यू में शरीर के वजन का आकलन करके इस उपन्यास HU तकनीक की सफलता निर्धारित की. चूहों की शारीरिक वजन एच यू (24.3 ± 2.9g) से पहले काफी एच यू के 14D (22.7 ± 1.9g), एच यू के 28d (21.3 2.1g +) के बाद या 3 दिन वसूली के बाद तुरंत गिरावट नहीं (24.0 ± 1.8g) . Soleus मांसपेशियों काफी क्रमशः 14 दिन और 28 दिन के लिए एच यू (0.001 <पी) के बाद अस्वीकृत (-39.1%, और -46.6%). बाद वसूली soleus मास की 3 दिन में काफी नियंत्रण मूल्यों की 74% वृद्धि हुई है. HU चूहों के अधिवृक्क वजन नियंत्रण चूहों की तुलना में अलग नहीं थे.
हमारे उपन्यास एच यू विधि की सफलता हू, उम्मीद साहित्य मूल्यों के लिए इसी 2, 7, 8 के बाद पशु शरीर के वजन, तुलनीय अधिवृक्क ग्रंथि वजन, और soleus शोष के रखरखाव द्वारा evidenced है . इस एच यू विधि का प्राथमिक लाभ में शामिल हैं:) 1 निलंबन के दौरान पूंछ परीक्षा के आराम, 2) cyanotic, सूजन, और / या परिगलित अक्सर पूंछ टेप और एच यू के साथ मनाया पूंछ की संभावना कम;) 3 चूहों की कोई संभावना नहीं कर्षण चबाने टेप और निलंबन तंत्र के बाहर आ रहा है, और 4) तेजी से वसूली और एच यू के तुरंत बाद सामान्य पिंजरे गतिविधि.
Protocol
पूर्व सर्जरी उपकरण / सामग्री
- वायर कटर / सरौता
- 2 x 2 "पैड धुंध
- हीटिंग पैड
- सिल्वर नाइट्रेट चिपक
- बाँझ सर्जिकल दस्ताने
- Isoflurane साँस लेना चतनाशून्य करनेवाली औषधि
- Chlorhexidine 4% (एंटीसेप्टिक शल्य साफ़) Gluconate
- बाँझ 2-0 शल्य चिकित्सा इस्पात सिवनी
- 25 एक्स 5 / 8 गेज सुई (Autoclaved)
- Hemostat (Autoclaved)
- सर्जिकल इस्पात सिवनी
सर्जरी प्रक्रिया
- एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ. बाँझ प्रक्रिया का पालन करें.
- 2 के साथ माउस anesthetize - 3% isoflurane.
- हीटिंग पैड पर माउस रखें.
- Chlorhexidine समाधान के साथ पूंछ सफ़ाई.
- पता लगाएँ 5, 6, या 7 वें intervertebral अंतरिक्ष (पूंछ पर दो बोनी धक्कों के बीच, पूंछ के आधार पर, शरीर के बालों के अंत से गिनती शुरू).
- Hemostat और दो कशेरुकाओं के बीच एक पायलट छेद करने के लिए 25g सुई के बीच की अंतरिक्ष में, का प्रयोग करें.
- इस्पात सिवनी 10 सेमी लंबी कटौती तार कटर का प्रयोग करें.
- सुई निकालें और छेद, सीवन के 5 सेमी के माध्यम से पूंछ के दोनों छोर पर स्टील सीवन सम्मिलित.
- पूंछ के प्रत्येक पक्ष + सीवन के 5 सेमी होनी चाहिए.
- जगह पूंछ पर अंगूठे टिप.
- अपने मुक्त हाथ का प्रयोग करें और इस्पात हवा सिवनी अपने अंगूठे की नोक पर समाप्त होता है और मोड़ करने के लिए एक बड़ा पाश फार्म. घाव या परिपत्र भाग + 3 लंबे समय मिमी होना चाहिए.
- अपने अंगूठे निकालें.
- Hemostat के साथ सीवन के एक कतरा दबाना है और यह एक छोटे पाश, जिनमें से यथासंभव मूल बड़े पाश पर मोड़ करने के लिए जुड़ा हुआ है अंत में मोड़.
- अतिरिक्त तार कट, और वापस मुड़ तार मोड़.
- अगर वहाँ किसी भी अधिक खून बह रहा है, आप इसे चांदी नाइट्रेट लाठी के साथ बंद कर सकते हैं.
- एक ही घर में 5-7 दिनों के लिए hindlimb उतराई से पहले ठीक पिंजरे में बंद isoflurane और जगह माउस मुड़ें. पूंछ के छल्ले उलझ अगर एक से अधिक माउस के साथ रखे है.
1. Hindlimb उतराई प्रक्रिया
माल
- 10-24 साइज़ एक्स 4 मशीन शिकंजा, प्रति एक जानवर.
- नायलॉन ताला अखरोट 10 आकार - 24, प्रति एक जानवर.
- विंग अखरोट का आकार 10 24 एक्स, दो पशु प्रति.
- वॉशर आकार ¼ 1 एक्स, दो पशु प्रति.
- तस्वीर हुक आकार # 6, 1-11/16 ", और एक प्रति पशु के साथ मत्स्य पालन कुंडा.
- धातु सिलाई मशीन अटेरन. एक प्रति जानवर.
- एस के आकार का हुक के लिए लघु पेपर क्लिप, एक प्रति जानवर
- चिमटा.
- 2 एक्स 2 धुंध ".
- 2 "काले कागज बांधने की मशीन clamps.
- डक्ट टेप / टेप प्रयोगशाला.
- 1-3/8 "मढ़वाया slotted इस्पात पट्टी है कि थोड़ा पिंजरे की पूरी लंबाई से परे फैली
- एक्स 50cm 40cm एक्स 20cm पिंजरे (चूहा पिंजरे).
- Bended ट्यूब के साथ पानी की बोतल.
- स्टेनलेस स्टील के तार, पानी की बोतल का समर्थन U-आकार की.
केज सेटअप
- 1-38 "मढ़वाया slotted पिंजरे के शीर्ष पर इस्पात पट्टी, और टेप डक्ट टेप के साथ यह अस्थायी नीचे लेटाओ.
- मशीन स्क्रू 1 पंख अखरोट भाड़ में, एक वॉशर को सम्मिलित करते हैं, और मशीन पेंच गर्त slotted इस्पात ± थाली पिंजरे के किनारे से 15 सेमी सम्मिलित.
- अन्य वॉशर और पंख अखरोट जोड़ें. दोनों पंख पागल कस, लेकिन कस, पूरी तरह से नहीं के रूप में यह समायोजन को बाद में आवश्यक हो जाएगा.
- अटेरन के केंद्र छेद के माध्यम से मशीन पेंच डालें.
- से गिरने से रोकने के अटेरन, मशीन स्क्रू के अंत करने के लिए नायलॉन ताला अखरोट पेंच. आज़ादी अटेरन कुंडा चाहिए.
- मछली पकड़ने कुंडा से अटेरन के निचले हिस्से के माध्यम से तस्वीर हुक डालें.
- सरौता क्लिप से एक एस के आकार का हुक के रूप में प्रयोग करें. (पेपर क्लिप से 2cm कट करने के लिए एक हुक के रूप में).
- कुंडा मछली पकड़ने के छेद के माध्यम से एस के आकार का हुक के एक छोर डालें और चुटकी यह सरौता के साथ बंद.
- यू के आकार का तार, पिंजरे पक्ष के अंदर पर मशीन स्क्रू करने के लिए समानांतर, प्लेस, और समाप्त होता है एक पूरा पानी की बोतल का समर्थन वापस मोड़.
- U-आकार तार में spicket नीचे सामना करना पड़ रहा है, लेकिन नीचे छू नहीं के साथ पानी की बोतल, सम्मिलित करें.
- 2 "बांधने की मशीन दबाना खुला झुको, तो वे बंद नहीं बंद कर सकते हैं बस में इसे बाहर गिरने के बिना करने के लिए पर्याप्त भोजन के 3 से 4 टुकड़ों पकड़ तनाव है कि. इस भोजन कुचल से क्लैंप के बल को रोकने है, या पर नीचे clamping माउस नाक.
- 3 से 4 बांधने की मशीन दबाना में कृंतक चाउ के टुकड़े प्लेस.
माउस के Hindlimb उतराई
- पूंछ अंगूठी के छोटे अंगूठी के माध्यम से एस के आकार का हुक के खुले अंत डालें.
- मशीन स्क्रू पर कम पंख अखरोट कस या ढीला द्वारा माउस ऊंचाई समायोजित करें. निचले extremities वजन असर नहीं होना चाहिए. एक बार इष्टतम ऊंचाई ऊपरी पंख अखरोट कस हासिल है.
- पानी की बोतल, और U-आकार तार reposition इतना है कि माउस spicket पर अपनी hindlimbs साथ नहीं चढ़ाई कर सकते हैं. डक्ट टेप के साथ पिंजरे के किनारे पानी की बोतल को सुरक्षित करो.
- पिंजरे के तल पर भोजन के साथ बांधने की मशीन दबाना स्थिति इतनी है कि माउस पर यह नहीं चढ़ाई कर सकते हैं, यह डक्ट टेप के साथ टेप नीचे.
- अगर एक से अधिक पशु hindlimb पिंजरे के दूसरे पक्ष पर उतार दिया है एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. हाउस पिंजरे प्रति दो पशुओं, जानवरों अंतरिक्ष इतना है कि वे लगभग एक दूसरे को स्पर्श कर सकते हैं.
- 2 एक्स 2 धुंध का प्रयोग शिथिल मछली कुंडा पर माउस की पूंछ लपेटो. धुंध के आसपास लपेटो, पूंछ के लिए धुंध हासिल टेप का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें. इस कदम नीचे drooping से पूंछ को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, पूंछ की नोक और कि परिगलित बनने पूंछ में पूलिंग रक्त के लिए अग्रणी.
- पिंजरे सिल बिस्तर की एक छोटी राशि जोड़ें. बहुत ज्यादा अन्यथा बिस्तर माउस बिस्तर और बिस्तर पर hindlimbs लोड करने का प्रयास के एक टीले से न जोड़ें.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
पूंछ अंगूठी एच यू तकनीक की सफलता की स्थापना के लिए हम पूंछ अंगूठी सर्जरी से पहले, और पहले और एच यू और वसूली के बाद पशु शरीर के वजन मापा, सभी समूहों में और अधिवृक्क जन; soleus मांसपेशियों.
प्रयोग भर में चूहों की शारीरिक वजन चित्र 1 में दिखाया जाता है. पूंछ अंगूठी सर्जरी (24.7 ± 3.5g) से पहले चूहों के शरीर के वजन पूंछ अंगूठी (24.3 ± 2.9g) सर्जरी एच यू के लिए पहले से वसूली के 5 दिनों के बाद काफी अलग नहीं थे. न ही शरीर के वजन काफी एच यू के 14 दिनों के बाद तुरंत गिरावट (22.7 ± 1.9g), एच यू के 28 दिनों (21.3 + 2.1g) या 3 एच यू (24.0 ± 1.8g) से दिन वसूली के बाद. हालांकि एच यू 14 और 28 दिनों के लिए शरीर मास में (-6.8% और 12%) छोटी लेकिन गैर महत्वपूर्ण नुकसान के परिणामस्वरूप, चूहों पूरी तरह से वसूली के 3 दिनों के बाद अपने पूर्व HU शरीर के वजन को बरामद. चल नियंत्रण चूहों और चूहों एच यू के लिए खाद्य की खपत 3 चित्र में दिखाया गया है. औसत दैनिक भोजन का सेवन HU चूहों में 28 दिन से अधिक नियंत्रण करने के लिए तुलना में अलग नहीं था.
हम 14 और 28 (-39.1%, और -46.6%) दिन एक प्रभावी एच यू प्रक्रिया (चित्रा 2) संकेत के लिए एच यू के बाद महत्वपूर्ण soleus पेशी शोष मनाया. इसके अलावा शोष के इस डिग्री एच यू 2, 7, 8 के 2-4 हफ्तों के लिए उम्मीद साहित्य मूल्यों के साथ संगत है. एच यू soleus मास से वसूली के बाद 3 दिन काफी नियंत्रण मूल्यों की 74% वृद्धि हुई है. वसूली समूह में Soleus बड़े पैमाने पर दोनों एच यू समूहों की तुलना में काफी अधिक था, लेकिन अभी भी काफी चल नियंत्रण पशुओं की तुलना में कम है.
अधिवृक्क वजन जानवर तनाव का एक संकेतक के रूप में मापा गया, दोनों बाएँ और दाएँ अधिवृक्क ग्रंथियों excised और तौला गया. औसत वजन नियंत्रण और एच यू सभी समूहों में चूहों चूहों (चित्रा 4) के लिए तुलनीय थे.
पहले हम चूहों में पता चला है कि पशुओं की संख्या (टेप पूंछ - कर्षण के माध्यम से चबाने पशुओं के कारण) है कि निलंबन तंत्र से बाहर आ रही बिना एच यू पूरा करने के लिए पशुओं की संख्या के लिए एच यू की शुरुआत में सफलता की दर की तुलना में 10 बाहर था 12 के मोरे - Holton एक तकनीक का उपयोग कर. चूहों के इस अध्ययन में कोई नहीं (n = 54) कभी निलंबन से नीचे एच यू अवधि के पूरा होने से पहले आया था. हम तथापि, एक माउस है कि एक गंभीर रूप से सूजन पूंछ विकसित किया. जब सूजन स्पष्ट हो गया, हम पूंछ अंगूठी निकाल सूजन क्षेत्र को ठीक करने की अनुमति है, और बाद में एक और पूंछ अंगूठी रखा एच यू की अवधि को पूरा करने के लिए.
अतीत में जब हम एच यू के मोरे - Holton विधि का इस्तेमाल किया है, हम आम तौर पर 1-2 चूहों / समूह को खत्म करने, क्योंकि वे निलंबन तंत्र के बाहर आते. निशान अंगूठी विधि के साथ वहाँ अनजाने में एच यू तंत्र के 14 या 28 दिनों (n = 54 चूहों) के लिए एच यू की अवधि के दौरान बाहर आ चूहों का कोई एपिसोड थे.
चित्रा 1. शारीरिक वजन परिवर्तन (± एसडी मीन). पहले एच यू (n = 54) सभी चूहों, HU14: चूहों hindlimb 14 दिनों (n = 34) के लिए उतार दिया; HU28: चूहों hindlimb के लिए उतार दिया; कांग्रेस: प्री - एच यू वजन रखनेवाला नियंत्रण चूहों (n = 76) लघुरूप 28 (n = 20) दिन, आरईसी: hindlimb उतार पिंजरे करने की अनुमति दी चूहों 3 दिन (n = 22) के लिए ठीक हो. शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण मतभेद समूहों के बीच मनाया गया.
चित्रा 2. Soleus पेशी शोष (± एसडी मीन). चूहों hindlimb 14 दिनों (n = 34) के लिए उतार दिया; HU28: 28 (n = 20) दिनों के लिए चूहों hindlimb उतार, और आरईसी: hindlimb उतार चूहों की अनुमति; कांग्रेस: HU14 वजन रखनेवाला नियंत्रण चूहों (n = 76) लघुरूप पिंजरे 3 दिन (n = 22) के लिए ठीक है. * गौरतलब वजन असर नियंत्रण (कांग्रेस) से अलग (पी <0.001). δSignificantly दोनों एच यू समूहों की तुलना में अलग (पी 0.01 <).
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चित्रा खाद्य 3. खपत (± एसडी मीन). वजन रखनेवाला और hindlimb उतराई के दौरान औसत दैनिक भोजन का सेवन (ग्राम / दिन). लघुरूप: वजन असर चूहों पर नियंत्रण (n = 76), एच यू: चूहों unloaded14 hindlimb - 28 दिन. कांग्रेस और एच यू समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद मनाया गया.
चित्रा 4 अधिवृक्क मास (± एसडी मीन). चूहों hindlimb 14 दिनों (n = 34) के लिए उतार दिया; HU28: 28 (n = 20) दिनों के लिए चूहों hindlimb उतार, और आरईसी: hindlimb उतार चूहों की अनुमति; कांग्रेस: HU14 वजन रखनेवाला नियंत्रण चूहों (n = 76) लघुरूप पिंजरे 3 दिन (n = 22) के लिए ठीक है. कोई महत्वपूर्ण मतभेद समूहों के बीच मनाया गया.
Discussion
हम hindlimb उतारने चूहों का एक वैकल्पिक तरीका है, जो हम अत्यधिक सफल होना निर्धारित मूल्यांकन किया है. विधि पूंछ अंगूठी के रूप में यहाँ वर्णित लंबी अवधि hindlimb निलंबन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और वसूली के बाद एच यू अध्ययन. इन शर्तों में से प्रत्येक के तहत, वहाँ के लिए अनुकूल स्थिर भोजन का सेवन शरीर के वजन, और चूहों के अधिवृक्क वजन द्वारा evidenced के रूप में विफलता के कोई सबूत नहीं था. यह पूंछ अंगूठी एच यू तकनीक प्रदर्शन करने के लिए आसान है और आसानी से बहुत कम शल्य चिकित्सा के अभ्यास के साथ शामिल किया जा सकता है.
वहाँ पारंपरिक 5 मोरे Holton, 6 विधि तुलना पूंछ अंगूठी विधि के कई फायदे हैं. सबसे पहले, कि पूंछ पर अंगूठी आरोपण साइट त्वचा हमेशा दिखाई दे रहे हैं, इसलिए यदि समस्याएं उत्पन्न होती है यह तुरंत स्पष्ट है, निलंबन अवधि के अंत में न सिर्फ. दूसरा, पशुओं के निलंबन तंत्र के बाहर किसी भी समय एच यू के दौरान मिलता है, कि एक माउस या डेटा सेट में नहीं रखने के लिए दृढ़ संकल्प के एक बनाने की जरूरत है obviating में सक्षम नहीं हैं. इसके अलावा, चूहों की अंगूठी तंत्र परेशान नहीं है और, जब वे वसूली के लिए एच यू से जारी कर रहे हैं, वे अपनी पूंछ के साथ छेड़छाड़ नहीं है, एक सहज वसूली एच यू निम्नलिखित चरण के लिए अनुमति देता है. अंत में, पूंछ अंगूठी विधि के साथ hindlimb उतार चूहों अपने शरीर के वजन को बनाए रखने चूहों hindlimb मोरे Holton तकनीक पूंछ - कर्षण द्वारा उतार से बेहतर. हमारे हाथ में एच यू के 14 दिनों के बाद हम शरीर मास में (-6.8%) छोटी लेकिन गैर महत्वपूर्ण नुकसान मनाया. जबकि Ingalls एट अल. एच यू के 14 दिनों के बाद मोरे - Holton विधि 3 के द्वारा चूहों में शरीर के वजन में एक महत्वपूर्ण -12% कमी मनाया . हालांकि Ingalls अधिवृक्क वजन रिपोर्ट नहीं था, यह प्रतीत होता है कि हमारे पूंछ अंगूठी विधि (हमारे HU चूहों में अधिवृक्क वजन नियंत्रण से अलग नहीं कर रहे हैं) माउस और hindlimb उतारने की अवधि के दौरान शरीर के वजन के बेहतर रखरखाव पर कम तनाव प्रदान है.
संक्षेप में, hindlimb उतराई के एक पूंछ अंगूठी विधि विकसित किया गया था और 14 और 28 दिनों के लिए एच यू चूहों पर परीक्षण किया, और चूहों पर एच यू के बाद 3 दिन के लिए पिंजरे वसूली के लिए लौटे. अधिवृक्क वजन, शरीर द्रव्यमान और भोजन का सेवन के आधार पर, चूहों को अच्छी तरह से पूंछ अंगूठी तंत्र के लिए अनुकूलित है दिखाई देते हैं. पूंछ अंगूठी विधि उतारने hindlimb एक उपयोगी, पारंपरिक मोरे Holton hindlimb उतराई तकनीक के लिए सरल विकल्प है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों को अपने पशुओं के लिए तकनीकी सहायता और देखभाल के लिए एक उत्कृष्ट हमारी प्रयोगशाला में स्नातक शोध छात्र, एंड्रयू जम्मू डन, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. स्वास्थ्य अनुदान HD058834 और मिसौरी जीवन विज्ञान फैलोशिप विश्वविद्यालय के राष्ट्रीय संस्थान इस काम वित्त पोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
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