Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Sommario

In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.

Abstract

Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l'interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell'organo è stata recentemente generato http://www.gudmap.org/ , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d'organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine ​​applicare candidato o abbattere l'espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l'applicabilità della cultura d'organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell'espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.

Protocollo

1. Reagenti per la preparazione digestione del rene

1. 1,5 ml di 0,25% Collagenasi A (w / v) e soluzione 1% Pancreatina digerire (w / v) saranno necessari per l'estrazione di cellule zona nefrogenica (NZCs) da 8 E17.5 reni. Perché Pancreatina dura circa 2 ore per sciogliere a temperatura ambiente, basta digerire soluzione per il maggior numero di rene embrionale attesi dovrebbero essere fatte prima dell'esperimento. Preparare digerire soluzione in primo luogo l'aggiunta di 25 mg di Collagenasi A fosfato 10 ml Soluzione salina tamponata Dulbecco (DPBS) in modo chiaro da 15 ml, provetta sterile. E 'fondamentale che il DPBS non contiene calcio e magnesio in quan....

Discussione

In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E 'lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all'interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti geneti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Orafo’pinze chirurgiche n. 5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 coppie richieste
Collagenasi A	Gruppo Roche	10 103 578 001	Indossare la maschera
Pancreatina suina	Sigma-Aldrich	P8096	Indossare la maschera
DPBS con Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	Con Mg &e Ca
Siero fetale bovino (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, di Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, di Life Technologies	10724-011	senza fattori di crescita aggiunti
L-Glutammina 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513	Usare al 1% v/v
PenStrep 10.000 U di penicillina/ml, 10 mg di streptomicina/ml	Sigma-Aldrich	P4333	Usare al 1% v/v
Fibronectina	BD Biosciences	356008	Fornito in polvere
Piastra per colture a 24 pozzetti	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS senza Mg && Ca	Lonza Inc.	17-512F
tubi in polistirene da 5 mL	BD Biosciences	352235
DNasi (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1,5 ml
filtro per cellule da 40 micron	BD Biosciences	352235	con tappo e tubo
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Usare al 4 % p/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Usare al 0,3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Fornito in polvere
Siero di asino	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Usare al 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Diluire 1:100
Anticorpo anti-coniglioβ-gal	MP Biomedicals	559762	Diluire 1:200
Oregon Green 488 falloidina	Invitrogen	O7466	Diluire 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Diluire 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Diluire 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glicerolo	EMD Millipore	GX0185-6	Mescolare il 50 % con H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Utilizzare "DNasi in colonna" protocollo
Pipette trasferibili, 3 ml	BD Biosciences	357575