Questo protocollo delinea un modo per etichettare e tracciare il destino dei piccoli gruppi di cellule di embrioni di zebrafish con UV-uncaging della fluoresceina in gabbia, seguita da montare tutto immunomarcatura per amplificare il segnale proveniente dal fluoresceina Uncaged.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Un problema centrale in biologia dello sviluppo è quello di dedurre l'origine della miriade di tipi di cellule presenti nei vertebrati che si presentano dai precursori indifferenziati. I ricercatori hanno utilizzato vari metodi di etichettatura lignaggio, come ad esempio l'etichettatura DII 1 e pressione di iniezione di enzimi tracciabili 2 per il destino della cellula accertare nelle fasi successive di sviluppo in sistemi modello. Le mappe destino primo pesce zebra (Danio rerio) sono state assemblate mediante iniezione iontoforetica di coloranti fluorescenti, come destrano rodamina, in celle singole in regioni discrete dell'embrione e tracciare il destino della cellula etichettata nel tempo 3-5. Anche se efficaci, questi metodi sono tecnicamente impegnativi e richiedono attrezzature specializzate non si trovano comunemente nei laboratori di zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteine fluorescenti, come Eos e Kaede, che irreversibilmente passare da verde a fluorescenza rossa quando esposta alla luce ultravioletta, stiamo vedendo un maggior uso in zebrafish 6-8. La chiarezza ottica dell'embrione pesce zebra e la relativa facilità della transgenesi hanno reso questi strumenti particolarmente interessanti per l'etichettatura di lignaggio e di osservare la migrazione delle cellule in vivo 7. Nonostante la loro utilità, queste proteine hanno alcuni svantaggi rispetto ai metodi lignaggio dye-mediata etichettatura. Il più importante è la difficoltà che abbiamo trovato per ottenere 3-D ad alta risoluzione durante fotoconversione di queste proteine. In questa luce, forse la migliore combinazione di risoluzione e facilità d'uso per l'etichettatura lignaggio in zebrafish si avvale della gabbia fluoresceina destrano, un colorante fluorescente che è associato a un gruppo di tempra, che maschera la sua fluorescenza 9. Il colorante può essere "Uncaged" (uscito dal gruppo tempra) all'interno di una cella specifica usando la luce UV di una lampada laser o mercurio, consentendo la visualizzazione della sua fluorescenza o immunolocalizzazione. A differenza dei metodi iontoforesi, fluoresceina in gabbia possono essere iniettati con apparati di iniezione standard e Uncaged con un microscopio a epifluorescenza dotato di un foro stenopeico 10. Inoltre, gli anticorpi contro la fluoresceina rilevare solo la forma Uncaged, e la fissazione epitopo sopravvive ben 11. Infine, fluoresceina in gabbia può essere attivato con altissima risoluzione in 3-D, soprattutto se la microscopia a due fotoni è impiegata 12,13. Questo protocollo descrive un metodo di etichettatura lignaggio di fluoresceina in gabbia e uncaging laser. Subsequenctly, Uncaged fluoresceina viene rilevato in contemporanea con altri epitopi come GFP, mediante l'etichettatura con gli anticorpi.
Protocollo
1. Sintesi di Caged Fluoresceina Destrano
- Misurare 3,5-4 mg di aminodextran e aggiungere nel Invitrogen fornito tubo colorato contenente 1 mg di CMNB-gabbia fluoresceina SE. Nelle nostre mani, questo rapporto dà un carico medio di circa 2,5 molecole di colorante per destrano.
- Aggiungere 500 ml di 0,1 M Na 2 B 4 O 7 tampone (borato di sodio) al tubo.
- Cap e vortex per 30 secondi per sciogliere il aminodextran e fluoresceina in gabbia.
- Lasciare reagire durante la notte su un miscelatore vortex.
- Svitare la chiusura in basso su una colonna di spin Zeba e allentare il tappo. Segna un punto ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Come descritto, questo protocollo fornisce un metodo relativamente rapido etichettatura lignaggio in zebrafish che si basa su delle tecniche comunemente usate di microiniezione, microscopia, ed immunofluorescenza. Abbiamo scoperto che il laser uncaging essere il modo più efficiente ed economica per uncage fluoresceina in maniera localizzata. Questo metodo potrebbe essere usato per etichettare lignaggio con endpoint sperimentale non più tardi di 4 dpf. Tuttavia, come le cellule si dividono, la gabbia-fluoresceina concent.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Dan Carlin per un aiuto nel fare fluoresceina in gabbia. Inoltre vorremmo ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Vanderbilt University Medical School di programma per Grant Developmental Biology di formazione per JAC, e NIH HD054534to JTG.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CMNB-fluoresceina SE caging | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodestrano, 10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Colonne spin per desalificazione Zeba | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| anticorpo caprone anti-fluoresceina | Invitrogen | A11095 | |
| anticorpo asino Alexa Fluor 633 anti-caprone | Invitrogen | A21082 | |
| Piastre di Petri 35 mm x 10 mm | BD Biosciences | 351008 | |
| Microscopio composto eretto con obiettivo a immersione in acqua 40x | Leica Microsystems | DM6000B | |
| Sistema manuale di illuminazione laser MicroPoint | Photonic Instruments | ||
| Feniltiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Proteinasi K | Roche Group | 03115836991 | |
| Filo di plastica | Qualsiasi fornitore | ||
| Agarosio | Research Products International Corp. | A20090 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| Mixer vortex | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| Microinjector a pressione | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Riferimenti
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
