Sette passi per Stellate Cellule

Sommario

Qui si descrive un metodo per l'isolamento delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Per la purificazione delle cellule stellate, fegati mouse sono digeriti In situ E In vitro Da pronasi-collagenasi trattamento prima centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica produce elevata purezza cellule stellate epatiche.

Abstract

Cellule stellate epatiche sono fegato residenti cellule simili a stelle morfologia e si trovano nello spazio di Disse tra fegato e cellule endoteliali sinusoidali ^1,2 epatociti. Cellule stellate sono derivati ​​dai precursori del midollo osseo e memorizzare fino a 80% del totale del corpo di vitamina A ^{1, 2.} Dopo l'attivazione, le cellule stellate differenziarsi in miofibroblasti per produrre la matrice extracellulare, contribuendo così alla fibrosi epatica ^3. Sulla base delle loro capacità di contrarsi, le cellule stellate myofibroblastic in grado di regolare il tono vascolare associata a ipertensione portale ^4. Recentemente, abbiamo dimostrato che le cellule stellate epatiche sono cellule che presentano l'antigene potenti e possono attivare le cellule NKT così come convenzionali linfociti T ^5.

Qui vi presentiamo un metodo efficiente per la preparazione delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Grazie alla loro localizzazione perisinusoidal, l'isolamento delle cellule stellate epatiche è un processo multi-step. Al fine di rendere accessibile a cellule stellate isolamento dallo spazio di Disse, fegati mouse sono perfusi in situ con l'pronasi E enzimi digestivi e Collagenasi perfusione P. In seguito, il tessuto epatico viene sottoposto ad ulteriore trattamento enzimatico con pronasi Collagenasi E e P vitro. Successivamente, il metodo sfrutta la massiccia quantità di vitamina A-la memorizzazione gocce lipidiche nelle cellule stellate epatiche. Questa funzione consente la separazione delle cellule stellate da altri tipi di cellule epatiche per centrifugazione su una pendenza dell'8% Nycodenz. Il protocollo qui descritto produce una popolazione altamente pura e omogenea delle cellule stellate. Purezza delle preparazioni può essere valutata dalla colorazione per il marcatore molecola di proteina gliale fibrillare acida (GFAP), prima dell'analisi al microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. Inoltre, microscopia luce rivela l'apparizione unica di cellule epatiche stellate a forma di stella che ospitano grandi quantità di goccioline lipidiche.

Nel loro insieme, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento efficiente delle cellule stellate epatiche, comprese le immagini rappresentative del loro aspetto morfologico e di espressione GFAP che contribuiscono a definire l'entità delle cellule stellate.

Protocollo

Topi C57BL / 6 dovrebbero essere usati a ~ 20 settimane di età o più. L'utilizzo di topi maschi del peso 25-30g è raccomandato. La resa di cellule stellate può essere aumentata di alimentazione topi un A-arricchito di vitamina dieta per 2 mesi prima di isolamento delle cellule stellate. Circa 2x10 ⁵ cellule stellate epatiche può essere purificato dal fegato di un C57BL / 6 del mouse, mentre la resa di cellule stellate da topi BALB / c è nettamente superiore. Il protocollo che segue è regolata a 5 topi. La cura degli animali e la sperimentazione sono state eseguite in conformità approvato Animal Care istituzionali e protocolli Comitato Usa.

Discussione

Cellule stellate epatiche regolano essenziali processi fisiologici e fisiopatologici nel fegato. Inoltre, le cellule stellate possiedono proprietà presentanti l'antigene, rendendoli una componente importante della risposta immunitaria epatica. Sebbene le cellule stellate epatiche costituiscono il 10-15% del numero totale di cellule nel fegato, l'isolamento di queste cellule è impegnativo a causa della loro localizzazione nello spazio di Disse perisinusoidal.

Qui vi presentiamo un met.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome di reagente	Azienda	Catalog No.
70μm cella Filtro	BD	352350
CaCl 2 x 2H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Collagenasi P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNasi I	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031-cv
EGTA	Fluka	3777
Siero bovino fetale	Gibco	16000
Glucosio	Sigma-Aldrich	G7528
Gradiente di centrifugazione Tubi	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Gibco	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutammina	Gibco	25030
MgCl 2 x 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 x 7H 2 O	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penicillina / streptomicina	Gibco	15140
Pompa peristaltica	Cole Parmer	HV-7523-70
Rosso fenolo	Sigma-Aldrich	P4633
E pronasi	Calbiochem	7433-2
Tubo di silicone	Masterflex	HV-96440-14
Piruvato di sodio	Gibco	11360
Tessuto fiasco cultura (25cm 2)	BD	353108
Infusione Set alato	Terumo	1SV27EL