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1. Considerazioni sulla clonazione
- Oligonucleotidi commercialmente preparato che rappresenta il TMD di interesse affiancato da NheI e siti di restrizione BamHI e 5'-fosforilato può essere legata in pTox7 (modificato nel nostro laboratorio mediante inserimento di una coppia di basi direttamente dopo il sito di restrizione BamHI 14) (Figura 3) digerito in sequenza con BamHI e NheI. Un oligonucleotide esempio è mostrato sotto:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
La sequenza TMD dovrebbe essere 12-24 residui (brevi sequenze presumibilmente sarà allungata da residui idrofobici vettore di codifica). Al fine di indagare l'interfaccia, quattro varianti del design TMD dovrebbero essere creati dove inserimenti residui sequenziale e concomitante risultato residui delezioni nel rotazione del relativo TMD a ToxR. 15,16, infine, la concentrazione arabinosio dovrebbe essere variato tra 0,001 e 0,01% (w / v) per identificare la concentrazione di cui si rilevino differenze massima β-galattosidasi segnali tra le diverse sequenze TMD, alla verifica dei livelli di espressione differenti si raccomanda di identificare condizioni di affinità diverse si possono distinguere meglio. Oltre a arabinosio e antibiotici, 0,4 mM IPTG possono essere utilizzate per migliorare le differenze di affinità tra TMD diverse. La misura ToxR dovrebbe essere eseguito almeno in quattro esemplari. Tutta la procedura dovrebbe essere ripetuta almeno tre volte con diverse trasformazioni plasmide.
2. La crescita di colture batteriche
- Delicatamente disgelo FHK12 cellule competenti (200 microlitri) su ghiaccio e trasferire in una provetta da 15 ml cultura. Aggiungi DNA plasmidico (200 ng) e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min.
- Heat-shock cellule mediante incubazione per 90 s a 42 ° C, seguita da incubazione in ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungi SOC mezzi di comunicazione (800 microlitri) e incubare i campioni a 37 ° C con agitazione (300 giri) per un h.
- Inoculare 5 media LB ml con cloramfenicolo (30 mg / ml) e arabinosio (0,0025% w / v) con 50 microlitri della miscela trasformazione in provette da 15 ml cultura in triplice copia. Incubare i campioni a 37 ° C con agitazione (300 rpm) per 20 h. (In alternativa 5 ml di cultura può essere utilizzato per inoculare 100 l di media in una piastra da 96 pozzetti. Questo metodo è utile quando si tratta di un gran numero di campioni, anche se gli errori saranno leggermente più alto. Al fine di evitare l'evaporazione, il che porterebbe per errore, riempire i pozzi più esterna con i media, ma non li usano per i campioni. Infine, doppio avvolgere la giunzione tra il coperchio e il piatto con parafilm).
3. Misura della β-galattosidasi
- Preriscaldare il piatto-reader a 28 ° C.
- Trasferire la Z-buffer in un serbatoio con un puntale di grandi dimensioni, facendo attenzione a prendere solo la parte superiore (acquoso) strato. Trasferire 100 ml di Z-buffer/chloroform preparati al momento ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Trasferire 5 ml di ciascuna cultura nei pozzetti della piastra in quattro esemplari. Omettere la cultura da quattro pozzi che servirà come il vuoto.
- Misurare il diametro esterno 595 del piatto per determinare la densità delle cellule.
- Aggiungere 50 ml di Z-buffer/SDS a tutti i pozzetti della piastra. Agitare la piastra sulla piastra-reader per 10 minuti a Lyze le cellule. Assicurarsi che le sospensioni cellulari sono chiare dopo la lisi e ripetere il passo tremante, se necessario. Lisi incompleta suggerisce il Z-buffer/chloroform non era preparato fresco.
- Aggiungere 50 microlitri preparati al momento Z-buffer/ONPG a tutti i pozzetti e tornare la piastra per il lettore di piastre e misurare OD 405 ogni 30 s per 20 min.
- Calcolare β-galattosidasi utilizzando la seguente equazione (ricordandosi di sottrarre il vuoto). Il rapporto di OD 405 / min deve essere calcolata utilizzando tutti i punti dati nel campo 405 OD 0,0-1,0 usando un adattamento lineare modello.
Unità Miller differiscono a volte quando registrate in giorni diversi. Quindi, un costrutto di riferimento come AAP dovrebbe essere misurata in ciascuna prova. I suoi valori possono essere utilizzati per la normalizzazione dei valori ToxR.
4. Controllo per l'espressione della proteina
- Eseguire Western blotting per verificare anche l'espressione della proteina tra i costrutti. Unire 50 ml di culture triplice copia e centrifuga (2000 rpm, 4 min) in una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e risospendere il pellet residuo in 2 tampone di caricamento del campione x.
- Carico di 7,5 microlitri su un gel standard 8% ed effettuare elettroforesi a 125 V per 1 ora 5 min. Dopo il trasferimento, incubare con anticorpi anti-MBP HRP-anticorpo coniugato e visualizzare, la proteina chimerica è osservata a circa 70 kDa con alcuni prodotti di degradazione a volte visto circa 48 kDa. MBP endogena è osservato anche a 45 kDa (Figura 5).
5. Controllo per l'inserimento corretto di membrana
Una linea di cellule carenti di proteina legante il maltosio viene utilizzato per valutare il corretto inserimento della membrana del costrutto chimerico TMD. Quando coltivate su terreno minimo con il maltosio come unica fonte di carbonio, solo le cellule che esprimono una membrana integrale prodotto espressione di proteine maltosio legame correttamente situato a periplasma sono in grado di crescere.
- PD28 trasformare cellule (come descritto per FHK12 cellule) e inoculare 2 ml di LB medium. Crescere le cellule a 37 ° C con agitazione (300 rpm) durante la notte.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 3500 rpm, 10 min, 4 ° C e lavare da risospensione in PBS (2 ml) pipettando dolce con una punta di grandi dimensioni o vortexando gentilmente. Agglomerare le cellule (come sopra), lavare con PBS per la seconda volta, pellet e risospendere infine, in PBS (1 ml).
- Usare 25 ml di cellule risospese per inoculare 5 Mezzi ml minimo in triplice copia e incubare a 37 ° C con agitazione (300 giri). Prendere OD 595 letture tra 15-25 h, circa ogni 2 ore con il trasferimento di 200 ul di ciascun campione in una piastra da 96 pozzetti e la lettura con la piastra-reader.
6. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di utilizzo del test ToxR giornalista trascrizionale di analizzare la propensione oligomerizzazione di domini transmembrana in Figura 4. In precedenza abbiamo studiato la oligomerizzazione di domini transmembrana dal multispanning membrana integrante latente della membrana proteica proteine-1 (LMP-1) con varie tecniche, tra cui ToxR 14 domini transmembrana cinque (TM5) è stato dimostrato che mostra una forte propensione a oligomerize.; ciò è dimostrato da alte Unità Miller, paragonabile al controllo positivo, GPA, una solida sequenza dimerizing. Una mutazione deleteria in TM5, D150A, riduce la capacità della sequenza di oligomerize. LMP-1 TM1 non influisce significativamente oligomerize e presenta un bassissimo segnale Unità Miller, appena sopra il segnale per il valore vuoto, non trasformato FHK12 cellule.
Cartoon Figura 1. Raffigurante il saggio giornalista ToxR. Dominio transmembrana (TMD) guidato risultati oligomerizzazione in dimerizzazione di ToxR e l'attivazione della trascrizione LacZ. Il prodotto del gene di LacZ, β-galattosidasi può essere quantificato in una misura della propensione di un TMD a oligomerize.
Figura 2. La scissione idrolitica di ONPG da β-galattosidasi risultati nella produzione di specie che assorbono la luce, o-nitrofenolato (ONP).
Figura 3. Plasmidi mappa di pToxR7.
Figura 4. Rappresentante saggio giornalista ToxR trascrizionale analizzare la propensione oligomerizzazione di membrana latente proteina-1 domini transmembrana. Dominio transmembrana 5 (TM5) oligomerizes fortemente, mentre il dominio transmembrana 1 (TM1) presenta solo una interazione debole. D150A mutazione in TM5 riduce in modo significativo la sua capacità di oligomerize. GPA è incluso come una sequenza di controllo positivo per dimerizzazione forte. Vuoto rappresenta FHK12 cellule non trasformate.
Figura 5. Western Blot per l'espressione delle proteine.
Figura 6. PD28 saggio di complementazione di controllo per l'inserimento della membrana corrette al periplasma. Controllo negativo rappresenta un costrutto carente di maltosio legame proteico.