Una procedura efficace per valutare la propensione oligomerizzazione del single-pass domini transmembrana (TMD) è descritta. Proteine chimeriche costituito dalla TMD fusa ToxR sono espressi in un ceppo di E. coli giornalista. TMD indotta oligomerizzazione cause dimerizzazione di ToxR, l'attivazione della trascrizione e la produzione della proteina reporter-galattosidasi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR
In questo articolo
Sommario
Abstract
La visione semplicistica di domini di proteine transmembrana semplicemente come ancore in doppi strati di fosfolipidi è stata da tempo confutata. In molti casi, attraversa la membrana le proteine si sono evoluti meccanismi altamente sofisticate di azione. 1-3 Un modo in cui le proteine di membrana in grado di modulare le loro strutture e delle funzioni avviene attraverso il contatto diretto e specifico di eliche idrofobiche, formando oligomeri transmembrana strutturato. 4,5 recente molto lavoro si è concentrato sulla distribuzione degli aminoacidi preferenzialmente trovato nell'ambiente della membrana rispetto alla soluzione acquosa e le forze intermolecolari diverse proteine associazione unità. 6,7 Tuttavia, gli studi di riconoscimento molecolare al dominio transmembrana di proteine ancora in ritardo rispetto quelli di solubili in acqua le regioni. Un grande ostacolo rimane: nonostante la notevole specificità e affinità che oligomerizzazione transmembrana può raggiungere, 8 misura diretta della loro associazione è impegnativo. Metodologie tradizionali applicati allo studio della funzione integrale proteina di membrana può essere ostacolato dalla insolubilità intrinseca delle sequenze in esame. Conoscenze acquisite studiando biofisici peptidi sintetici che rappresentano domini transmembrana in grado di fornire utili visione strutturale. Tuttavia, la rilevanza biologica del micellare detergente o sistemi di liposomi utilizzati in questi studi per imitare le membrane cellulari è spesso messa in discussione; fare peptidi adottare un nativo struttura simile in queste condizioni e che il loro comportamento funzionale rispecchiano le reali modalità di azione all'interno di una membrana nativa ? Al fine di studiare le interazioni delle sequenze transmembrana in doppi strati di fosfolipidi naturali, il laboratorio Langosch sviluppato test giornalista trascrizionale ToxR. 9 Il dominio transmembrana di interesse è espresso come una proteina chimerica con maltosio legame con le proteine per la posizione al periplasma e ToxR a fornire una relazione del livello di oligomerizzazione (Figura 1).
Negli ultimi dieci anni, diversi altri gruppi (ad esempio Engelman, DeGrado, Shai), ulteriormente ottimizzato e applicato questo saggio giornalista ToxR. 10-13 I saggi ToxR vari sono diventati un gold standard per testare interazioni proteina-proteina nelle membrane cellulari. Siamo qui dimostrare una tipica operazione sperimentale condotto nel nostro laboratorio che segue principalmente i protocolli sviluppati da Langosch. Questo metodo generalmente applicabile è utile per l'analisi di dominio transmembrana auto-associazione in E. coli, in cui viene utilizzato β-galattosidasi produzione per valutare la propensione TMD oligomerizzazione. Su TMD indotta dimerizzazione, ToxR si lega al promotore ctx causando up-regolazione del gene LacZ per β-galattosidasi. Una lettura colorimetrica ottenuto mediante aggiunta di ONPG alle cellule lyzed. Scissione idrolitica di ONPG da β-galattosidasi risultati nella produzione di specie che assorbono la luce, o-nitrofenolato (ONP) (Figura 2).
Protocollo
1. Considerazioni sulla clonazione
- Oligonucleotidi commercialmente preparato che rappresenta il TMD di interesse affiancato da NheI e siti di restrizione BamHI e 5'-fosforilato può essere legata in pTox7 (modificato nel nostro laboratorio mediante inserimento di una coppia di basi direttamente dopo il sito di restrizione BamHI 14) (Figura 3) digerito in sequenza con BamHI e NheI. Un oligonucleotide esempio è mostrato sotto:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
La sequenza TMD dovrebbe essere 12-24 residui (brevi sequenze presumibilmente sarà allungata da residui idrofobici vettore di codifica....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La trascrizione saggio giornalista ToxR è un modo facile per identificare sequenze transmembrana con la possibilità di oligomerize. Dato che le interazioni avvengono all'interno della membrana batterica interna, questo saggio aggira i problemi associati con la validità dei sistemi di studiare in ambienti di membrana-mimetici. Dato che la clonazione di TMD multipli in un singolo plasmide può facilmente essere fatto in parallelo e il test completo può essere effettuata in 96-ben formato piatto, questo test può essere .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il National Institutes of Health (1R21CA138373 e Stand Up to Cancer (SU2C) per supporti finanziari di questo lavoro. HY è grato per la Award 2009 Elion dalla American Association of Cancer Research, un Kimmel Scholar Award dalla Fondazione per la Sidney Kimmel Ricerca sul Cancro (SKF-08-101), e la National Science Foundation Facoltà primi Premio alla Carriera (NSF0954819).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Enzima di restrizione BamHI | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzimi sono stati trovati per essere più efficiente di altri fornitori |
| NheI enzima di restrizione | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzimi sono stati trovati per essere più efficiente di altri fornitori |
| Provette da 15 ml cultura | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC mezzi di comunicazione | Teknova | S0225 | Composto al volume appropriato e sterilizzati in autoclave. |
| LB mezzi di comunicazione | Sigma-Aldrich | L7275 | Composto al volume appropriato e sterilizzati in autoclave. |
| Cloramfenicolo | Sigma-Aldrich | CO 3 78 | Soluzione madre di 30 mg / ml in etanolo conservati in congelatore |
| Arabinosio | Fluka | 10839 | Soluzione madre di 2,5% (w / v) in acqua immagazzinata nel congelatore |
| Na 2 HPO 4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH 2 PO 4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt chimici | 6858-06 | |
| MgSO 4 0,7 H 2 O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Dodecylsulfate sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galattopiranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16,1 g di Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g di KCl 0.246g MgSO 4 Portare a 1 l, pH 7,0 | ||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoetanolo, 2 ml di cloroformio, portare a 20 ml con Z-buffer. Vortex per 1 min, centrifugare per 1 min a 800 giri al minuto. Fai fresco per ogni piatto. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS sciolto in 10 mL di Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | ONPG 40 mg in 10 ml di Z-buffer. Fai fresco per ogni piatto | ||
| β-mercaptoetanolo | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP anticorpi monoclonali (HRP coniugata) | NEB | E8038S | |
| Terreno minimo con maltosio | 1 x M9 sali, 0,4% maltosio, 1 mg / mL tiamina, 2 mM MgSO 4 | ||
| 96 pozzetti fondo piatto | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Piastra-reader | Beckman Coulter | DTX880 Detector Multimode | |
| Bagnomaria | VWRI | 89032-204 | |
| Scuotendo incubatore | FormaScientific |
Riferimenti
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
