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Articolo metodologico

Test di screening per Stress Ossidativo in una linea felina cella astrociti, G355-5

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DOI:

10.3791/2841

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13 luglio 2011

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1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences, 3ReadiSorb, Products

In questo articolo

Sommario

Un metodo di screening per individuare gli ambienti ossidativo cellulare è quello di misurare l'ossidazione delle CM-H2DCFDA. Una volta ossidato all'interno di una cella di CM-H2DCFDA cambiamenti da non fluorescente in un composto fluorescente. Questo cambiamento di fluorescenza viene misurata mediante citometria di flusso e indica il numero di cellule in un ambiente ossidativo.

Abstract

Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo. Astrociti svolgono un ruolo importante nel controllo dello stress ossidativo del Sistema Nervoso Centrale (SNC). Astrociti aiutare a mantenere un ambiente omeostatico per i neuroni così come proteggere i neuroni da specie reattive dell'ossigeno (ROS). CM-H2DCFDA è una cellula-permeabile indicatore per la presenza di ROS. CM-H 2 DCFDA entra nella cellula come un non-fluorescenti composte, e diventa fluorescente dopo esterasi cellulari rimuovere i gruppi di acetato, e il composto viene ossidato. Il numero di cellule, misurato mediante citometria di flusso, che si trovano ad essere fluorescente verde è l'indicazione del numero di cellule che sono in uno stato ossidativo. CM-H 2 DCFDA è suscettibile di ossidazione da un gran numero di differenti ROS. Questa mancanza di specificità, per i quali ROS possono ossidare CM-H 2 DCFDA, rende questo composto un reggente prezioso per l'utilizzo nelle prime fasi di un'indagine patogenesi, in quanto questo test può essere usato per individuare un ambiente ossidativo cellulare, indipendentemente da quale ossigeno radicale o la combinazione di ROS sono responsabili per le condizioni di cellulare. Una volta stabilito che i ROS sono presenti dall'ossidazione di CM-H 2 DCFDA, poi ulteriori esperimenti possono essere eseguiti per determinare quale ROS o combinazione di Ross sono coinvolti nel processo di patogenesi particolare. I risultati di questo studio dimostrano che con l'aggiunta di perossido di idrogeno, un aumento della CM-H 2 DCFDA fluorescenza è stato rilevato rispetto ai controlli salina, indicando che questo test è un test importante per la rilevazione di un ambiente ossidativo all'interno G355-5 celle, un felina linea cellulare astrociti.

Protocollo

1. Colture cellulari di astrociti felino e il trattamento con H 2 O 2

  1. Linea cellulare cultura G355-5 in un centimetro 75 2 pallone con i media DMEM più nutrienti a 37 ° C e 5% di CO 2 fino al 60% confluenti (~ 5 giorni). Sostituire i media ogni 1-2 giorni o secondo necessità per mantenere una sana cultura.
  2. Rimuovere i supporti e aggiungere 2 ml di tripsina 0,25%. Sollevare le cellule pipettando per 45 s - 1 minuti a temperatura ambiente (RT).
  3. Trasferire rapidamente la sospensione in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di media. Mescolare delicatamente.
  4. Centrifugare a 300 xg, 23 ° C per 3 minuti per ottenere un pellet. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
  5. Aggiungere 6-7 ml di mezzi freschi e risospendere le cellule.
  6. Aggiungi ~ 1 ml di cellule in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere 2-3 ml di media per ciascun pozzetto e incubare fino al 80-90% confluenti.
  7. Preparare una soluzione 100μM di perossido (H 2 O 2) in media.
  8. Rimuovere i supporti di ogni bene e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi (di controllo), 2 ml di H 2 O 2 (trattamento) o 2 ml di DPBS. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 3 ore
  9. Rimuovere soluzioni e aggiungere 1 ml di tripsina per sollevare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf contenente 0,5 ml DPBS. Questa operazione deve essere eseguita su ogni bene singolarmente al fine di prevenire la morte cellulare di incubazione tripsina prolungato.
  10. Spin a 300 xg per 3 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 1 ml di DPBS.

2. Colorazione per ROS

  1. Tutti i passaggi per la colorazione deve essere effettuata con un minimo l'esposizione alla luce per evitare l'imbiancamento.
  2. Aggiungere 1 ml di 50 mM CCCP per il controllo positivo. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 5 min.
  3. Aggiungere 5 ml di 10 mm CM-H 2 soluzione DCFDA per l'H 2 O 2 gruppi. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 15-30 min. Nessuna macchia è aggiunto al campione salina.
  4. Lavare i campioni con 2 ml di DPBS per rimuovere macchie residue.
  5. Spin a 300 xg per 3 minuti per ottenere un pellet.
  6. Risospendere le cellule in 0,5 ml di DPBS. Aggiungere 1 PI microlitri di ciascun campione, ad eccezione della soluzione salina.
  7. Trasferire i campioni in una provetta da 5 ml citofluorimetro.
  8. Esegui il citofluorimetro.

3. Citometria a flusso

  1. Esegui campioni su un Beckman Coulter FC500 (o equivalente) dotato di un laser ad argon 488 nm e la passa banda seguenti: 525, 775 e 620 nm, tutti ± 20 nm.
  2. Preparare i controlli del caso: le cellule senza macchia, CM-H 2 DCFDA colorato solo, solo PI, macchiato doppio (controllo negativo).
  3. Fai un protocollo che ha il histoplots seguenti: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Si dovrebbero inoltre avere la istogrammi seguenti: numero di cellulare vs FL1, FL2 e FL3, che corrisponde alle macchie.
  4. Prima di eseguire i campioni, controllare le attrezzature, fluidi e contenitore per rifiuti. Riscaldare il materiale per almeno 20 min.
  5. Pulire le attrezzature e effettuare una calibrazione con le perline appropriato secondo le norme produttori.
  6. Selezionare il protocollo ed eseguire gli esempi.
  7. Pulire l'apparecchiatura come fatto in precedenza.
  8. Pulire la linea del vuoto secondo le norme produttori.
  9. Spegnere il flusso e pulire la testina / vuoto linea.
  10. Disattivare il software e il computer.

4. Rappresentante dei risultati:

Risultati di citometria a flusso sono stati analizzati utilizzando FlowJo 7.6 e controlli macchia sono stati utilizzati per impostare oggettivamente gating. Sulla base di questo, le cellule sane appaiono sulla sinistra dell'istogramma e ROS (stress ossidativo) è stato rilevato come uno spostamento di celle a destra. La Figura 1 mostra i risultati degli effetti del perossido di idrogeno a salutare astrociti felino. I dati di FL1 è stato utilizzato per misurare l'intensità di CM-H 2 DCFDA, che indica la presenza di ROS. Come previsto, una maggiore quantità di ROS è stata rilevata nel campione trattato con H 2 O 2. Questo viene visualizzato l'istogramma come un cambiamento di intensità fluorescente da sinistra a destra. Quando si confrontano le cellule sane trattate con DMEM contro DPBS, non c'era nessun cambiamento significativo nella quantità di ROS (Fig. 2).

Figura 1
Figura 1. Citometria a flusso risultati dei livelli di stress ossidativo in soggetti sani astrociti felino e l'effetto di H 2 O 2 sulle cellule sane. I risultati indicano che H 2 O 2 aumenta i livelli di ROS nelle cellule sane rispetto alle cellule con nessun trattamento (DMEM).

Figura 2
Figura 2. Citometria a flusso risultati dei livelli di ROS rilevato nelle cellule sane incubate per 3 ore con DPBS.

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Discussione

Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. In sostanza, si propone che attraverso l'esposizione virale della glia (astrociti e microglia) radicali rilasciano ossigeno reattive come, idrossido, anione superossido, ossido nitrico, e / o perossido di idrogeno, che sono tossici per i neuroni. Allo stesso modo, lo stress ossidativo è stato anche suggerito come un importante meccanismo patologico in metanfetamine neurotossicità i...

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Dichiarazioni

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Ringraziamenti

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
DMEM Cellgro 15-013-CV
MEM Vitamine Cellgro 25-020-cl 1% (v / v)
L-glutammina Hyclone 17-605E 1% (v / v)
Non amminoacidi essenziali Hyclone 25-025-cl 1% (v / v)
FBS Hyclone SH30071.03 20% (v / v)
Aminoacidi essenziali Cellgro 25-030-cl 0,2% (v / v)
500ml vuoto sistema di filtrazione VWR 87006-076
Provette da 15 ml Falco 352097
75 centimetri due colture di tessuti fiaschi Falco 353136
6 e piastra di coltura dei tessuti Falco 353224
CM-H 2 DCFDA Invitrogen C6827
Propidio ioduro (PI) Sigma P4170-10mg
Tripsina Lonza 17-160F
H 2 O 2 Sigma H6520
HyQ antibiotici Hyclone SV30079.01 0,1% (v / v)
G355-5 cellule ATCC CRL-2033 Normale cervello felino

Riferimenti

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