Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Sommario

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Abstract

Cardiaco cellule immunitarie stanno guadagnando interesse per i ruoli che svolgono nella rimodellamento patologico in molte malattie cardiache ^1-5 Queste cellule del sistema immunitario, che includono i mastociti, le cellule T ei macrofagi;. Immagazzinare e rilasciare una varietà di mediatori biologici attivi tra cui citochine e proteasi, quali triptasi. ^6-8 Questi mediatori hanno dimostrato di essere giocatori chiave nel metabolismo della matrice extracellulare, attivando metalloproteinasi della matrice o causare accumulo di collagene modulando il fibroblasti cardiaci 'funzione. ^9-11 Tuttavia, le tecniche disponibili per isolare le cellule immunitarie hanno cardiaca stato problematico perché usano collagenasi batterica per digerire il tessuto miocardico. Questa tecnica causa attivazione delle cellule immunitarie e di conseguenza una perdita di funzione. Per esempio, i mastociti cardiaci diventano significativamente meno sensibili ai composti che causano la degranulazione. ¹² Perciò, abbiamo sviluppato una tecnica che permette di tche l'isolamento di cellule cardiache funzionali del sistema immunitario che porterebbe ad una migliore comprensione del ruolo di queste cellule nelle malattie cardiache. ^{13, 14}

Questo metodo richiede una certa familiarità con la posizione anatomica del ratto processo xifoideo, ascella e legamento falciforme, pericardio e del cuore. Questi punti di riferimento sono importanti per aumentare il successo della procedura e per garantire una maggiore resa di cellule immunitarie cardiaco. Queste isolato cellule cardiache immunitarie possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione di funzionalità, fenotipo, la maturità e co-coltura con altri esperimenti cellule cardiache per ottenere una migliore comprensione delle loro interazioni.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione Balance Hanks 'Salt (HBSS)

1. Autoclave 1 bicchiere di vetro L, 1000 mL cilindro graduato, e mescolare bar.
2. Ricostituire la soluzione polvere HBSS in autoclave L 1 bicchiere di vetro per il marchio di 900 ml con acqua bidistillata.
3. Mescolare soluzione HBSS con 3,4 g di sale Hepes Na + e regolare il pH a un valore compreso tra 7,35-7,41 utilizzando concentrato HCL o NaOH.
4. Una volta che il pH desiderato è stato raggiunto e rimane stabile, aggiungere 5 g di BSA per la soluzione a temperatura ambiente fino a quando la albumina è completamente sciolto.
5. Aggiungere 10 ml di acqua antibiotico, an....

Discussione

Questo metodo di isolare le cellule immunitarie cardiaca permette l'analisi della loro funzione, fenotipo, e la maturità senza l'attivazione indesiderata che si verifica in genere nel corso di una tecnica tradizionale isolamento digestione enzimatica. Il numero medio totale di cellule ottenute con questa tecnica è di circa 400.000 per il cuore di ratto, e colorazione differenziale e l'analisi di citometria a flusso di queste cellule indica popolazione mista di linfociti T (~ 70%), i macrofagi (~ 12%) e masto.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente e	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hanks Balanced Salt '	Sigma	H4891	Una bottiglia fa 1 L di Salt Balance Hanks ' Soluzione. Equilibrio ricostituire Hanks 'Salt Soluzione come parte della procedura.
Antibiotico-Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Albumina di siero bovino	Sigma	A3912
Flacone da 250 ml Nalogene Filtro	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	Per 6 N, aggiungere volumi uguali di HCL al deionizzataacqua.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	Per 5 N, aggiungere volumi uguali di NaOH in acqua deionizzata.
Doppia acqua distillata

Tabella di attrezzature specifiche:

Nome del reagente e	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3-O sutura in seta intrecciata	Ethicon Products	SA64H
Ventilatore piccoli animali	CWE Incorporated	SAR-830	Impostare la velocità di respirazione a 40,5 respiri al minuto.
Smusso 18 gauge	BD Biosciences	305199	Trim aghi di 1 / 2 a 3 / 4 della sua lunghezza originale per l'uso come un tubo tracheale.
Teflon Tip (con ago rimosso) di 24-gauge Baxter rapido cath catetere	Baxter	2N111	Ridurre la lunghezza punta in Teflon da 1 / 2 a 3 / 4.
10 cc siringa	Fisher Scientific	14-823-16B
15 ml Falcon Tubi	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B centrifuga refrigerata	Fisher Scientific	75-004-377	Ricordarsi di pre-raffreddare e conservare a 4 ° C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Emocitometro	Hausser scientifico	HS-LB-1483