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Preparazione E18 neuroni corticali di ratto fetale per compartimentazione
Prima di partire, è importante per scaldare tutti i supporti necessari e reagenti a 37 ° C.
E 'anche importante per sterilizzare tutto ciò che viene utilizzato per la preparazione delle cellule (ad esempio, le lampadine gomma, portaprovette, bottiglie media, ecc), e ciò che è posto nel cofano, con l'annientamento verso il basso con il 70% di etanolo.
- Mettere due pezzi di corteccia di ratto E18 fetale (un cervello, precedentemente sezionato) in una provetta da 15 ml contenente 1 ml ghiacciata calcio-magnesio libero senza buffer di dissezione.
- Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla corteccia dissezione nel buffer, portando il volume finale a 2 ml e la concentrazione di tripsina finale a 0,125%.
- Posizionare il tubo di 15 ml in un bagno d'acqua a 37 ° C per 8 minuti.
- Durante questo periodo, il fuoco lucidare 3 pipette Pasteur di vetro, formando aperture sempre più piccoli, in un armadio di biosicurezza per aiutare a mantenere la sterilità.
- Dopo l'incubazione 8 minuti della corteccia, aggiungere 10 ml di DMEM contenente 10% FBS alla corteccia per aiutare a fermare la reazione tripsina.
- Centrifugare i 15 tubo ml contenente la corteccia e DMEM/10% FBS a 2500 rpm per 2 minuti.
- Nell'armadio biosicurezza, rimuovere il sopranatante della corteccia con una pipetta Pasteur in vetro sottovuoto con aspirazione allegato. Fare attenzione a non disturbare o rimuovere il pellet.
- Aggiungere 1 ml di NMB al pellet di corteccia e pipettare delicatamente su e giù. E 'molto importante evitare di creare bolle d'aria, mentre pipeting su e giù, come le bolle d'aria può danneggiare le cellule dall'ossidazione.
- Usare il fuoco lucido pipetta Pasteur con la più ampia apertura verso triturare la corteccia ed accompagnato da una lampadina sterile gomma fino alla fine e pipeting su e giù per 5 volte, sempre facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Continuare questo processo con gli altri 2 pipette di vetro, ciascuna con una dimensione di apertura ridotto.
- Dopo la triturazione, centrifuga giù le cellule di nuovo a 2500 rpm per 2 minuti.
- Dopo la centrifugazione, ancora una volta, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di NBM.
- Filtrare la soluzione risospeso cellula attraverso un colino 45 celle um.
- Macchia le cellule con Blu tripan, contati, e caricati nel dispositivo. Noi di solito carico 20 ul di cellule per dispositivo.
Nota: la concentrazione finale di cellule è in genere tra 2,5 milioni di cellule / ml e 8 milioni di cellule / ml
Caricamento in corso le cellule
Dopo che le cellule sono state contate, è tempo di caricare le cellule del dispositivo:
- Portare i dispositivi precedentemente preparato contenente NBM nel mobile biosicurezza per mantenere la sterilità.
- Rimuovere i supporti in eccesso dai pozzi di aspirazione. Tuttavia, fare attenzione a evitare di rimuovere tutti i mezzi di comunicazione - ci deve essere qualche supporto nel canale principale.
- Applicare 20 ul di cellule al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo (vedi schema se necessario). Il flusso di cellule nel dispositivo e attaccarsi alla superficie trattata PLL.
- Dopo il caricamento, posizionare i dispositivi contenenti cellule indietro in un incubatore per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare.
- Dopo 10 minuti, riempire i serbatoi con i media e dispositivi di luogo indietro nell'incubatrice.