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Articolo metodologico

Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

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⸱

DOI:

10.3791/3071

⸱

22 luglio 2011

 ,  , 
1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un ottimizzato In vitro Test in grado di identificare squilibrio immunitario nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1.

Abstract

Cellule T regolatorie (Tregs) sono mediatori critici della tolleranza immunitaria di auto-antigeni. Inoltre, essi sono regolatori cruciali della risposta immunitaria in seguito ad un infezione. Nonostante gli sforzi per identificare marcatori unica superficie sulla Tregs, l'unica caratteristica unica è la loro capacità di sopprimere la proliferazione e la funzione delle cellule T effettrici. Mentre è chiaro che solo saggi in vitro possono essere utilizzati nella valutazione funzione umana Treg, questo diventa problematica in sede di valutazione dei risultati di studi trasversali in cui le cellule sane e cellule isolate da pazienti con malattie autoimmuni (come il diabete di tipo 1, diabete di tipo 1) è necessario da confrontare. C'è una grande variabilità tra i laboratori del numero e del tipo di risponditore cellule T, la natura e la forza della stimolazione, Treg: rapporti responder e il numero e il tipo di cellule presentanti l'antigene (APC) utilizzati in test di soppressione umani in vitro. Questa variabilità rende il confronto tra studi di misurazione funzione Treg difficile. Il campo Treg ha bisogno di un test standardizzato di soppressione che funzionano bene con entrambi i soggetti sani e quelli con malattie autoimmuni. Abbiamo sviluppato un test in vitro di soppressione che mostra poca variabilità intra-saggio nella stimolazione delle cellule T isolate da volontari sani rispetto ai soggetti con sottostante distruzione autoimmune delle cellule β pancreatiche. L'obiettivo principale di questo pezzo è quello di descrivere un test di soppressione umani in vitro che permette il confronto tra gruppi di soggetti diversi. Inoltre, questo saggio ha il potenziale per delineare una piccola perdita in nTreg funzione e anticipare ulteriormente la perdita per il futuro, individuando così i soggetti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia immunomodulante preventiva 1. Di seguito, forniamo la descrizione accurata delle fasi di questa procedura. Speriamo di contribuire alla standardizzazione dei test in vitro soppressione utilizzato per misurare la funzione Treg. Inoltre, offriamo questa analisi come strumento per riconoscere uno stato iniziale di squilibrio immunitario e un potenziale biomarcatore funzionale per diabete di tipo 1.

Protocollo

1. Prima di impostare un test di soppressione, si ha la necessità di perline cappotto tosylactivated con anti-CD3 umano (clone UCHT1, 1μg/ml concentrazione finale) per la stimolazione delle cellule e poi verificare se le perle sono rivestiti in modo efficiente attraverso la creazione di un test in vitro proliferazione utilizzando umano cellule T

  1. Prendere 1 ml di M-450 perle tosylactivated dal flacone originale, mettere in stand magnetici e tenere premuto fino a quando tutte le perle hanno aderito al lato del tubo. Rimuovere il tubo di buffer mentre è ancora in stand magnetico. Prendete del tubo di supporto magnetico e aggiungere 1 ml di buffer1, posizionare il tubo in stand magnetico di nuovo e togliere il tubo buffer1 mentre è in stand magnetici; perline risospendere in 1 ml di buffer1 e aggiungere 40μl di anti-CD3 umano, agitare a 37 ° C per 15 minuti, aggiungere 0,1% w / v BSA e continuare agitazione per le prossime 16 ore.
  2. Lavare le perline in buffer2 due volte per 5 minuti a 2-8 ° C e una volta in buffer3 per 5 minuti a 2-8 ° C con supporto magnetico, come spiegato sopra; rimuovere il buffer e risospendere le sfere in 1ml di buffer2, le perle sono 4x10 concentrazione 8 / ml finale e pronto per l'uso.
  3. Aliquota 50.000 e 25.000 PBMC / e in triplice copia in una piastra da 96 pozzetti e aggiungere numero variabile di perle rivestite CD3 (4x10 8 perline / ml, CD3 1μg/ml, ad esempio 1, 2, 3, 4, 5 perle / cella ) al fine di determinare il numero ottimale di perle per cella. Dopo 72 ore di cultura, aggiungere 1μCi [3 H] timidina e continuare incubazione a 37 ° C per le prossime 16 ore. Celle di raccolta in lamiera raccolta Multisala (Millipore), aggiungere liquido di scintillazione e leggere i conteggi per minuto (cpm) / bene usando Top Conte NXT (Packard, CT). Utilizzare le perline / rapporto cellulare quando CPM sono superiori a 5000 ma inferiore a 15000 per evitare iperstimolazione Tregs, che potrebbe perdere la funzione soppressiva. Di solito, rapporto di 3 perle / delle cellule stimola sia responder e le cellule Treg in tutti i gruppi di soggetti testati finora 1-4.

2. Isolamento PBMC da sangue intero da donatori sani o da leukopacks umano o buffy-coat (BC) di solito tratto da volontari sani e disponibili gratuitamente presso Centri locali Trasfusionale (Figura 1)

  1. Diluire il BC (~ 50 ml) 1:6 con PBS (aggiungere 250 ml). Ora c'è 300ml volume totale. Lentamente strato 25ml di BC diluito in cima 15ml Ficoll-Paque PLUS aggiunto a tubi Falcon da 50 ml, senza disturbare gli strati. Centrifugare a 800xg (1400rpm in una centrifuga Sorvall con rotore oscillante SH-3000) per 30 minuti a 4 ° C, con freni spento.
  2. Raccogliere accuratamente lo strato PBMC (fase intermedia) e trasferirlo in una nuova tubi Falcon da 50 ml. Lavare PBMC compilando i tubi fino a 50 ml con DPBS. Raccogliere due pellet cellulari in un tubo. Centrifugare a 400xg per 10 minuti a 4 ° C. Ripetere il lavaggio passo due volte, ogni volta che combina due pellet cellulari in un unico tubo. Unire tutti gli pellet cellulari in un unico tubo 50ml.
  3. Conte PBMC mediante test di esclusione tripan blu. Effettuare una diluizione 1:10 in Tricloroetano aggiungendo 20μl di PBMC di 180μl di Tricloroetano macchia. Mescolare bene e prendere 20μl a contare in emocitometro immediatamente. Contare i numeri di tutte le cellule senza macchia e solo blu macchiato situati in due blocchi quadrati ciascuno contenente 16 quadrati più piccoli. Prendere la media di entrambi i numeri e moltiplicare per 10. Dividere questo numero per 100 per ottenere il numero di PBMC / ml. Percentuale di cellule vitali calcolare come [1 - (numero di cellule blu / numero di cellule totali) x100]. Procedere, se la vitalità è ≥ 95%.

3. MACS pre-tipo di cellule T CD4

  1. Prima di procedere, il trasferimento di 1ml di PBMC in un tubo nuovo, aggiungere 4 ml di media per preparare le cellule per irraggiamento con 5000rad-questi saranno cellule presentanti l'antigene (APC).
  2. Centrifugare il resto delle celle a 250xg nel buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA per 10 minuti a 4 ° C. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml di tampone PBS/2mM EDTA/0.5% BSA.
  3. Aggiungere 200μl di MACS microsfere anti-CD4 e incubare a 4 ° C per 20 minuti.
  4. Lavare con l'aggiunta di 40 ml di tampone PBS/2mM EDTA/0.5% BSA e centrifugare a 250xg per 10min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere in 8ml di degassata, temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% buffer di BSA.
  5. Filtro separato la sospensione cellulare con pre-filtri di separazione prima di caricarli su una colonna LS.
  6. Dividere la sospensione cellulare e 4ml strato di ogni colonna LS oltre calibrato (con 3 ml di tampone deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA). Colonna LS è stato risolto nel separatore MidiMACS. Prima di sospensione cellulare si esaurisce, o rieseguire eluato o aggiungere 3 ml di temperatura ambiente deggassed PBS/2mM tampone EDTA/0.5% BSA e lasciare scorrere il buffer. Aggiungere più di buffer fino a quando non viene fuori chiara.
  7. Pipettare 5 ml di buffer deggassed sulla colonna LS, rimuovere colonna LS dal separatore MidiMACS e posto in una nuova provetta sterile raccolta 15ml lasciar correre ~ 1,0 ml attraverso. Mettere lo stantuffo nella colonna e spingere lentamente il resto delil volume in uscita.
  8. Fate lo stesso con entrambe le colonne LS e combinare le due frazioni CD4 +. Aggiungi fino a 50ml di PBS e contare le cellule. Rendimento atteso è fino a 5x10 8 cellule. Centrifugare a 400xg per 10 minuti e risospendere le cellule bene in 2 ml di buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA.

4. Fluorescente attivato cella Ordinamento (FACS), isolamento (Figura 2)

  1. Fai un cocktail di anticorpi marcatori CD per i seguenti marcatori superficie cellulare (tenere al riparo dalla luce): 20 ml di anti-umano CD8-FITC (clone RPA-T8), 20 ml di anti-umano CD14-FITC (clone M5E2; LPS recettore), 20 ml di anti-umano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR di tipo II) e 6 ml di anti-umano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα catena) e, in alternativa, aggiungere l'anti 40μl umani CD4-APCCy7 (clone RPA-T4).
  2. Prendete 5μl dalla sospensione cellulare 2ml e macchia con 2μl di cocktail macchia, questo è un tubo per la determinazione della soglia (Fluorocromo Minus One-FMO) 5.
  3. Aggiungere 50 ml di anti-umano CD25-PE (clone M-A251, IL-2Rα) al cocktail macchia, e aggiungere il cocktail di sospensione cellulare e incubare a 4 ° C 30 minuti. Lavare le cellule in tampone PBS, centrifugare a 400xg per 10 minuti e risospendere le cellule ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml.
  4. Preparare le cellule senza macchia e cellule o perline colorate con solo fluorocromo da usare come controllo della compensazione per l'ordinamento delle cellule di FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
  5. Acquisire le cellule nel tubo FMO che permetterà all'utente di impostare la soglia per l'ordinamento delle cellule T CD25 + (Figura 2a). Impostare un cancello intorno FITC-negativi cellule per escludere FITC cellule positive composto da monociti, macrofagi e tutti gli altri CD4 +-non-cellule T (Figura 2b).
  6. In un grafico distinto, disegnare cancelli per CD25-, CD25low e CD25high cellule T-Tregs (top 1% delle cellule che esprimono il maggior numero di CD25) (Figura 2c). Sottoinsiemi di cellule mostrano tipicamente elevata purezza (figura 2d, 2e e 2f).
  7. Centrifuga provette con celle a 400xg per 10 minuti e tenerli in ghiaccio fino placcatura.

5. Istituito colture cellulari in piastra da 96 pozzetti (schema allegato come Tabella 1) in 200μl/well

  1. 50μl aliquota di CD3 rivestite perle (1 mg / ml) calcolato da 3 perline / cella responder in un pozzo, risospesi in mezzi di comunicazione completa con il 10% pool di siero umano AB in U-bottom piastre a 96 pozzetti. (Ad esempio, per rendere i media 2ml con CD3 rivestita, prendere 7.5μl dal magazzino del CD3 rivestite perle-finale 4x10 concentrazione 8 / ml e diluire in 2 ml di media, ogni 50μl conterrà 75.000 beads-3beads/cell).
  2. Diluire APC irradiati concentrazione cellulare di 5x10 5 / ml e aggiungere 50μl (conterrà 2,5 x 10 4 cellule) in ciascun pozzetto con la stimolazione aggiunto in precedenza, tra cui pozzi etichettato come "Tregs solo", "APC solo" e "media solo" nella tabella 1.
  3. Aggiungere 2,5 x 10 4 / pozzetto CD4CD25 o CD4CD25low cellule T in triplicato a seguito di progettazione nella tabella 1.
  4. Aggiungi Tregs di co-culture (riga B, Tabella 1) nel rapporto 1:10 (2.500 cellule Treg) e di pozzi etichettati come "Tregs solo" e incubare la piastra a 37 ° C in CO 2 incubatore al 5% di CO 2 , satura di umidità per 72 ore.
  5. Pulse pozzetti con 1μCi [3 H] timidina e continuare l'incubazione a 37 ° C per la prossima 16 ore.

6. La raccolta e il conteggio

  1. Celle di raccolta sul piatto raccolta multischermo con Packard filtermate mietitrice o sistema alternativo.
  2. Aggiungere liquido di scintillazione (Microscint 20), la raccolta di copertura piatto con coperchio in plastica trasparente, in preparazione per la fase finale.
  3. Leggi conteggi per minuto (cpm) / bene usando Top Conte NXT (Packard, CT) o un sistema alternativo.

7. Percentuale di calcolo di soppressione

  1. Le cellule sono state coltivate in triplicato, medio è calcolato per ogni condizione. Se il coefficiente di variazione è> 30%, il valore anomalo è eliminato e solo cpm da due pozzi sono nella media. Percentuale di repressione si ottiene calcolando [(sc) / s] x 100%, dove s = cpm in singola cultura e c = cpm in co-coltura.
  2. Come ingenuo (CD25-) e in vivo attivato (CD25low) cellule T effettrici sono placcati come responder cellule T, la differenza nella capacità di Tregs di sopprimere ciascuno di questi sottoinsiemi è catturato e usato come indicatore prognostico potenziale funzionale sulla base del presupposto che le cellule attivate sono più difficili da sopprimere.

8. Rappresentante dei risultati:

Grande variabilità nei metodi utilizzati e dei risultati derivanti da test in vitro soppressione umano ci hanno spinto a effettuare uno studio completo delle condizioni che influenzano l'analisi 1. Abbiamo sviluppato un test che mette alla prova non solo la funzione Treg, ma anche la loro purezza, considerando il basso rapporto tra Tregs: Teffs (1:10), che abbiamo stabilito in precedenza 6. Inoltre, Tregs differiscono in thEIR capacità di sopprimere con successo ingenuo e in vivo-cellule T attivate, anche in soggetti sani, come mostrato nella Figura 3 e nei nostri studi precedenti 2,4, che diventa più evidente se l'equilibrio immunitario è compromesso, come nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1 . Il test ha funzionato molto bene nello studio dove abbiamo confrontato funzione soppressiva del naturale (nTregs), inducibile (iTregs) e in vitro nTregs espanso, che ci permette di confrontare tra loro funzione di controllo sani, di recente insorgenza (RO) diabete di tipo 1 e di vecchia data (LS ) dei soggetti diabete di tipo 1. Abbiamo concluso che i soggetti RO diabete di tipo 1 ha una migliore capacità di generare funzionale sia iTregs e nTregs ampliato rispetto ai soggetti di controllo LS T1D e sano 7. Pertanto, questo test può essere utilizzato come un ottimo strumento per il riconoscimento di entrambi uno stato precoce e tardivo di squilibrio del sistema immunitario.

Schema 1 Rappresentazione schematica delle fasi coinvolte nel test in vitro soppressione

Figura 1
Figura 1. Fasi del test in vitro soppressione presentata con foto

Figura 2
Figura 2. Strategia di gating in cella di isolamento FACS. a) CD25 soglia + è stata regolata secondo Fluorocromo Minus One (FMO), b) le cellule sono state gated come FITC-negativi, c) FITC-negativi cellule sono state ulteriormente gated e raccolto come CD + CD25-, CD + CD25low e CD + CD25high ( Tregs) dimostrato con percentuali, d), FACS ordinati Tregs dopo l'ordinamento, e), FACS ordinati CD + CD25low dopo l'ordinamento, ed f) FACS ordinati CD4 + CD25-cellule T dopo l'ordinamento

Figura 3
Figura 3. I risultati rappresentativi di soggetti sani a) i risultati rappresentante di conteggi al minuto (cpm) dei soggetti sani presenta come singole culture per tutti i sottoinsiemi di cellule coinvolte (ingenuo-CD25-, in vivo attivato-CD25low, cellule presentanti l'antigene-APC e cellule T regolatorie-Treg), così come co-colture di cellule T responder (CD25-o CD25low) e Tregs. b) Percentuale di soppressione di ogni CD25-e CD25low responder cellule T autologhe da Tregs è presentato per i soggetti sani di controllo (n = 4). Soppressione è stato calcolato come [(sc) / s] x 100%, dove s = cpm in singola cultura e c = cpm in co-coltura. Anche se lieve differenza nella capacità di Tregs per sopprimere le cellule T responder è stato notato, non era significativa (paired t-test p = 0,08). C) Presentato sono cpm di soggetti a rischio per ogni singola cultura, tra CD25 e CD25low come responder cellule T e APC e Tregs, e co-culture in cui è seminato ogni cella risponditore T sottoinsieme con Tregs (CD25-/Tregs e CD25low/Tregs). d) Percentuale di soppressione di ogni CD25-e CD25low responder cellule T autologhe da Tregs è presentato per i soggetti a rischio (n = 4). La differenza nella capacità di Tregs per sopprimere CD25-versus CD25low responder cellule T è stata significativa (paired t-test p = 0,04).

Tabella 1. Schematica messa a punto di test in vitro soppressione

1-3 4-6 7-9 10-12
A CD4CD25- CD4CD25low mezzi di comunicazione solo mezzi di comunicazione solo
B CD4CD25-/ Tregs CD4CD25low / Tregs Tregs solo APC solo
C
D
E
F
G
H

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Discussione

Essendo l'unica caratteristica unica di Tregs, la funzione di soppressione dovrebbero essere testati in modo affidabile e uniformemente tra soggetti nelle diverse fasi di sviluppo della malattia all'interno della stessa e tra studi differenti. Offriamo i dettagli del test di soppressione sviluppato nel nostro laboratorio come il nostro contributo alla standardizzazione di questo test. Nel nostro studio di ottimizzazione ampio, abbiamo determinato che la stimolazione delle cellule T con anti-CD3 umano rivestite p...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da Max McGee Nazionale delle Ricerche Centro Giovanile Diabetesat Medical College del Wisconsin e bambini Research Institute of Wisconsin. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta el'analisi dei dati, o la preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente o strumento Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03
DPBS-1X Gibco 14190-144
Tricloroetano Invitrogen 15250-061
anti-CD4 microsfere Miltenyi 130-045-101
Pre-separazione filtri Miltenyi 130-041-407
LS colonna Miltenyi 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA Sigma-Aldrich B4287
Anti-umano CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852
Anti-umano CD25-PE (clone M-A251, IL-2Rα) BD Pharmingen 555432
Anti-umano CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366
Anti-umano CD14-FITC (clone M5E2; recettore LPS) BD Pharmingen 555397
Anti-umano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR di tipo II) BD Pharmingen 555448
Anti-umano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα catena) BD Pharmingen 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-CD3 umano Ancell 144-024
Buffer1 Fatto in casa 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2 Fatto in casa PBS/2mM EDTA / 0,1% di BSA pH7.4
Buffer3 Fatto in casa 0,2 M Tris/0.1% BSA pH8.5
Completo RPMI dei media Fatto in casa RPMI 1640 i media 2 mM L-glutammina 5 HEPES mM 100 U / mg / ml Peni / strept 0,5 mM di piruvato di sodio
[3 H] timidina Perkin Elmer NET027Z005MC
pool di siero umano AB Atlanta Biologicals S40110
Raccolta piastra multischermo Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621

Riferimenti

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