Articolo metodologico

Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

DOI:

10.3791/3071

⸱

22 luglio 2011

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1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

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Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un ottimizzato In vitro Test in grado di identificare squilibrio immunitario nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1.

Abstract

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Cellule T regolatorie (Tregs) sono mediatori critici della tolleranza immunitaria di auto-antigeni. Inoltre, essi sono regolatori cruciali della risposta immunitaria in seguito ad un infezione. Nonostante gli sforzi per identificare marcatori unica superficie sulla Tregs, l'unica caratteristica unica è la loro capacità di sopprimere la proliferazione e la funzione delle cellule T effettrici. Mentre è chiaro che solo saggi in vitro possono essere utilizzati nella valutazione funzione umana Treg, questo diventa problematica in sede di valutazione dei risultati di studi trasversali in cui le cellule sane e cellule isolate da pazienti con malattie autoimmuni (come il diabete di tipo 1, diabete di tipo 1) è necessario da confrontare. C'è una grande variabilità tra i laboratori del numero e del tipo di risponditore cellule T, la natura e la forza della stimolazione, Treg: rapporti responder e il numero e il tipo di cellule presentanti l'antigene (APC) utilizzati in test di soppressione umani in vitro. Questa variabilità rende il confronto tra studi di misurazione funzione Treg difficile. Il campo Treg ha bisogno di un test standardizzato di soppressione che funzionano bene con entrambi i soggetti sani e quelli con malattie autoimmuni. Abbiamo sviluppato un test in vitro di soppressione che mostra poca variabilità intra-saggio nella stimolazione delle cellule T isolate da volontari sani rispetto ai soggetti con sottostante distruzione autoimmune delle cellule β pancreatiche. L'obiettivo principale di questo pezzo è quello di descrivere un test di soppressione umani in vitro che permette il confronto tra gruppi di soggetti diversi. Inoltre, questo saggio ha il potenziale per delineare una piccola perdita in nTreg funzione e anticipare ulteriormente la perdita per il futuro, individuando così i soggetti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia immunomodulante preventiva 1. Di seguito, forniamo la descrizione accurata delle fasi di questa procedura. Speriamo di contribuire alla standardizzazione dei test in vitro soppressione utilizzato per misurare la funzione Treg. Inoltre, offriamo questa analisi come strumento per riconoscere uno stato iniziale di squilibrio immunitario e un potenziale biomarcatore funzionale per diabete di tipo 1.

Protocollo

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1. Prima di impostare un test di soppressione, si ha la necessità di perline cappotto tosylactivated con anti-CD3 umano (clone UCHT1, 1μg/ml concentrazione finale) per la stimolazione delle cellule e poi verificare se le perle sono rivestiti in modo efficiente attraverso la creazione di un test in vitro proliferazione utilizzando umano cellule T

  1. Prendere 1 ml di M-450 perle tosylactivated dal flacone originale, mettere in stand magnetici e tenere premuto fino a quando tutte le perle hanno aderito al lato del tubo. Rimuovere il tubo di buffer mentre è ancora in stand magnetico. Prendete del tubo di supporto magnetico e aggiungere 1 ml di buffer1, p....

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Discussione

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Essendo l'unica caratteristica unica di Tregs, la funzione di soppressione dovrebbero essere testati in modo affidabile e uniformemente tra soggetti nelle diverse fasi di sviluppo della malattia all'interno della stessa e tra studi differenti. Offriamo i dettagli del test di soppressione sviluppato nel nostro laboratorio come il nostro contributo alla standardizzazione di questo test. Nel nostro studio di ottimizzazione ampio, abbiamo determinato che la stimolazione delle cellule T con anti-CD3 umano rivestite p.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da Max McGee Nazionale delle Ricerche Centro Giovanile Diabetesat Medical College del Wisconsin e bambini Research Institute of Wisconsin. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta el'analisi dei dati, o la preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente o strumento Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03
DPBS-1X Gibco 14190-144
Tricloroetano Invitrogen 15250-061
anti-CD4 microsfere Miltenyi 130-045-101
Pre-separazione filtri Miltenyi 130-041-407
LS colonna Miltenyi 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA Sigma-Aldrich B4287
Anti-umano CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852
Anti-umano CD25-PE (clone M-A251, IL-2Rα) BD Pharmingen 555432
Anti-umano CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366
Anti-umano CD14-FITC (clone M5E2; recettore LPS) BD Pharmingen 555397
Anti-umano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR di tipo II) BD Pharmingen 555448
Anti-umano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα catena) BD Pharmingen 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-CD3 umano Ancell 144-024
Buffer1 Fatto in casa 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2 Fatto in casa PBS/2mM EDTA / 0,1% di BSA pH7.4
Buffer3 Fatto in casa 0,2 M Tris/0.1% BSA pH8.5
Completo RPMI dei media Fatto in casa RPMI 1640 i media 2 mM L-glutammina 5 HEPES mM 100 U / mg / ml Peni / strept 0,5 mM di piruvato di sodio
[3 H] timidina Perkin Elmer NET027Z005MC
pool di siero umano AB Atlanta Biologicals S40110
Raccolta piastra multischermo Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R.

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Saggio di soppressione in vitroMisurazione della funzione delle TregCellule T regolatorieSorting tramite citometria a flussoCellule T CD4 positiveIncorporazione di timidina tritiataCellule mononucleate del sangue perifericoCellule presentanti l antigeneScreening dello squilibrio immunitarioBiomarcatore del diabete di tipo 1

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