Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

Sommario

Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.

Abstract

FlexStation il Molecular Devices '3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E 'ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca ^{2 +-permeabile} canali ionici e G-proteine ​​recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca ^{2 +} livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell'attivazione. In questo video, dimostriamo l'applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca ^{2 +-sensitive} colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l'applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L'effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.

Protocollo

1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti

Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA

1. HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%.
2. Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml in acqua distillata sterile) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per almeno 15 min. Lavare ogni pozzetto una volta con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) senza Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +} (Thermo Scientific, SH3002803). La piastra può essere lasciato nel cofano coltura cellulare per qualche ora.
3. Per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, diluire in 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,2 mcg cDNA in 25 microlitri OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Scalare fino proporzionalmente in base al numero di pozzi da transfettate con il cDNA stesso. Anche diluire in un apposito 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,4 microlitri Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 microlitri OPTI-MEM per ogni bene a essere transfettate. Questa scala fino in base al numero totale di pozzi per essere transfettate.
4. Brevemente vortice del 2000 cDNA diluito e Lipofectamine e lasciarli stare alla temperatura ambiente per circa 5 min.
5. Trasferire un volume uguale della Lipofectamine diluito 2000 per il tubo che contiene il cDNA diluito, vortex e lasciare che la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti a 2 ore. Durante questo tempo, trasferire il cDNA / Lipofectamine 2000 miscela al 49 microlitri / bene al poli-L-ornitina placca rivestita.
6. Trypsinize le cellule HEK293 (Punto 1.1), conta la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule contessa automatizzati (Invitrogen, C10227), e trasferire una quantità desiderata di cellule (generalmente circa ~ 125,000-150,000 cellule / pozzetto) a 15 ml sterile conica con fondo provetta da centrifuga. Centrifugare a 1000 RPM x per 5 min. Risospendere le cellule a ~ 1,250,00-1,500,000 cellule / ml nel terreno di coltura DMEM, supplementato con 10% di siero siero fetale bovino, ma senza antibiotici.
7. Dispensare 98 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto che contiene il cDNA-Lipofectamine 2000 utilizzando una miscela pipetter multicanale o il Dispenser Microplate Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% di CO ₂ per 20-44 ore.

Per le cellule HEK293 che esprimono stabilmente TRPA1

8. Seguire i passi da 1,2 a cappotto piastre a 96 pozzetti.
9. La linea inducibile HEK293-hTRPA1 cella era generosamente fornito dal Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) e mantenuto nel mezzo come il wild-type cellule HEK293 (Punto 1.1) ma integrata con 5 mcg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) e 50 mg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Quando densità cellulare raggiunge circa il 90%, trypsinize cellule, conta densità cellulare, e centrifugare la quantità desiderata di cellule a 1000 x RPM per 5 min. Risospendere le cellule ad una densità di circa 1.000.000 cellule / ml nel terreno di coltura stesso integrato con doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 mg / ml).
10. Dispensare la sospensione cellulare rivestito di lastre di poli-L-ornitina a 100 l / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ per 16 - 24 ore.

2. Soluzioni

1. Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) è usato come soluzione extracellulare. Esso contiene (in mm): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0,25 Na ₂ HPO _4, 0,44
   KH ₂ PO _4, 1,3 CaCl _2, 1,0 MgSO _4, 1,0 MgCl _2, 10 di glucosio, 10 HEPES, con pH regolato a 7,4 con NaOH 1N).
2. Fluo-4 tampone contiene 2 mM probenecid in HBSS. Fai 250 mm magazzino probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Diluire a HBSS con un rapporto di 1:125. Regolare il pH a 7,4 con 1 N HCl.

3. Celle di carico con Fluo-04:00

1. Sciogliere 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) nel 912 microlitri di DMSO anidro per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Il Fluo-4:00 soluzione madre può essere conservata a -20 ° C per almeno un mese.
2. Mix 10 microlitri 1 mM-Fluo 04:00 con 10 microlitri Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) in DMSO) e poi trasferire l'intero contenuto di 5 ml Fluo-4 tampone (Step 2.2) integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (Sigma, A9418).
3. Lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti (passo 1,7 o 1,10) con HBSS a 80 microlitri / ben 2 volte con una rondella di micropiastre (come ELx405TM da Bio-Tek).
4. Aggiungere il Fluo-4 AM carico soluzione (Fase 3.2) a 50 microlitri / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek) e incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora.
5. Lavare le cellule 3 volte con il Fluo-4 tampone (Punto 2.2.) Utilizzando la rondella micropiastre ELx405TM. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 80 ml di buffer di Fluo-4 test in ciascun pozzetto.

4. Preparazione del piatto composto

1. Durante il periodo 1 cella di carico ora, preparare una serie di diluizioni 3x di agonisti (o antagonisti) di 3x delle concentrazioni finale desiderato nel buffer di Fluo-4 test.
2. Pipetta 250-300 ml di soluzioni composto diluito ad una piastra composto da 96 pozzetti. Provvede alla traduzione della diluizioni seriali di un composto e dei controlli positivo e negativo corrispondente nella stessa colonna del piatto composto ogni volta che è possibile perché FlexStation 3 recita una colonna alla volta.

5. Di lettura targhe in FlexStation 3

1. Accendere il sistema (FlexStation 3, computer e il SoftMax Pro 5.2 del software)
2. Salva l'esperimento con un nuovo nome. Al set-up, scegliere la modalità FLEX e immettere i seguenti valori:

Protocollo n. 1, effetto agonista

Protocollo n. 2, effetto antagonista

3. Inserire una nuova casella punta, piatto composto e la piastra di lettura per i vassoi appropriato in FlexStation 3 e fare clic sul pulsante "leggere". Il FlexStation 3 sarà letta una colonna alla volta e aggiungere composti nei punti di tempo programmato senza interrompere la lettura. Ci vogliono circa 3 minuti (5 min per il protocollo # 2) per finire di leggere una colonna e la macchina continua a leggere la colonna successiva, con aggiunte composto eseguito come programmato dall'utente al passo 5,2 fino a quando tutte le colonne vengono letti.

6. Analisi dei dati

1. I dati sperimentali possono essere trattati direttamente con il SoftMax Pro 5.2 del software o copiato e incollato in qualsiasi programma di foglio di calcolo, come Microsoft Excel. Curva concentrazione-risposta di un acido TRPA1 agonista flufenamic (FFA), è costruito utilizzando i seguenti minimi quadrati routine di montaggio. , Dove Y è la risposta osservata, Y _max è la risposta normalizzata massima, C è la concentrazione del farmaco corrispondente, CE ₅₀ è la concentrazione che evoca una mezza massima risposta, e n _H è il coefficiente di Hill apparente. Concentrazione di inibizione curva per un presunto TRPA1 composto antagonista A è ottenuta utilizzando una concentrazione fissa di FFA (100 micron), e progressivamente aumentando la concentrazione di A. composto IC ₅₀ Valore del composto A si calcola minimi quadrati al seguente equazione. , Dove Y è la risposta osservata e Y _max è normalizzata risposta di picco, [Ant] è il composto corrispondente A di concentramento, IC ₅₀ è la concentrazione di antagonista che produce la metà-massimale inibizione della FFA-risposta evocata e n _H è la collina apparente coefficiente.

7. Rappresentante dei risultati:

TRPA1 è un ^+-permeabile canale catione Ca ^2, l'attivazione dei quali porta a afflusso di calcio che può essere rilevato dal Ca ^{2 +-sensitive} colorante, Fluo-4 (1-2). Una linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile è stato utilizzato per studiare la concentrazione-risposta di TRPA1 agonisti e antagonisti. Le cellule sono state caricate con Fluo-4 AM, posto in 80 microlitri della tampone, e leggere con FlexStation 3. Dopo aver registrato la fluorescenza di base per 30 s, 40 ml di una diluizione di serie del agonista TRPA1, FFA, ciascuno a 3 volte la concentrazione finale desiderata, sono stati aggiunti alle cellule attraverso un multi-canale pipetter incluso come parte del modulo fluidica di FlexStation 3. I cambiamenti fluorescenza sono stati monitorati per ulteriori 180 s. Le variazioni relative Fluo-4 fluorescenza per ciascun pozzetto sono stati espressi come ΔF = (F - F _0), dove ₀ F e F sono i valori di fluorescenza, al momento di interesse e l'inizio della lettura, rispettivamente. Tracce rappresentante dei corsi tempo ai cambiamenti fluorescenza in risposta ad una serie di concentrazioni di FFA sono mostrati in fig. 1. Nota per le ultime quattro concentrazioni di FFA, anche se i livelli di risposta massima sono simili, la cinetica di attivazione è chiaramente più veloce al superiore alle concentrazioni inferiori FFA. Pertanto, per distinguere queste differenze, la concentrazione - relazione dose-risposta è stato costruito misurando i tassi iniziali (pendenza) di aumento di fluorescenza dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA (Fig. 2). L'effetto mezzo massimoconcentrazione ive (CE ₅₀₎ di FFA è stato determinato in 55,4 mM (n = 3). Per testare la putativo TRPA1 antagonista, composto A, abbiamo effettuato un esperimento simile con protocollo n. 2 (punto 2). In questo caso, una serie di diluizioni del antagonista sono stati aggiunti a 30 s (40 ml di 3x concentrazione finale desiderata) e il FFA è stato aggiunto dopo 180 s (60 microlitri a 300 mM per una concentrazione finale di 100 mM). Composto A dose-dipendente ridotto la risposta delle cellule TRPA1 di FFA con una mezza massima concentrazione inibente (IC ₅₀₎ di 4,3 mM (n = 3) (Fig. 2).

Figura 1. Concentrazione-dipendente l'attivazione di TRPA1 umani da parte di FFA. Le tracce sono aumentare FFA-evocato di fluorescenza nel tempo (risposta solo nei primi 60 s vengono mostrati per illustrare meglio la cinetica veloce del FFA-evocate risposte). Si informa che alle alte concentrazioni di FFA evocato aumento di fluorescenza con una cinetica molto più veloce rispetto a concentrazioni inferiori, anche se i livelli di picco di fluorescenza erano simili.

Figura 2 Concentrazione -. Relazioni risposta per FFA cambiamento indotto fluorescenza e composto A indotta inibizione della risposta FFA umani TRPA1 stabilmente espressi in cellule HEK293. Δ, la concentrazione - relazione dose-risposta di FFA è stata determinata misurando il tasso iniziale (pendenza) di aumento di fluorescenza normalizzata dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA. O, concentrazione-risposta di inibizione della FFA-evocata risposta di calcio da un presunto TRPA1 antagonista, composto A.

Discussione

Intracellulare di Ca ^{2 +} gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d'azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca ^{2 +} intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca ^{2 +-permeabile} canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di
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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96-Beh, FlexStation Pipettare Consigli	Molecular Devices	9000-0912
Piastre a 96 pozzetti	Greiner Bio-One	655090
96-ben chiaro piastre a fondo piatto	Co-star	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo, 04:00	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poli-L-ornitina	Sigma	P36551
probenecid	Sigma	P8761
Albumina di siero bovino	Sigma	A9418