Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

Sommario

Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.

Abstract

FlexStation il Molecular Devices '3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E 'ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca ^{2 +-permeabile} canali ionici e G-proteine ​​recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca ^{2 +} livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell'attivazione. In questo video, dimostriamo l'applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca ^{2 +-sensitive} colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l'applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L'effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.

Protocollo

1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti

Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA

1. HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%.
2. Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 2....

Discussione

Intracellulare di Ca ^{2 +} gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d'azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca ^{2 +} intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca ^{2 +-permeabile} canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di
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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96-Beh, FlexStation Pipettare Consigli	Molecular Devices	9000-0912
Piastre a 96 pozzetti	Greiner Bio-One	655090
96-ben chiaro piastre a fondo piatto	Co-star	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo, 04:00	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poli-L-ornitina	Sigma	P36551
probenecid	Sigma	P8761
Albumina di siero bovino	Sigma	A9418