Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.
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Articolo metodologico
Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3
In questo articolo
Sommario
Abstract
FlexStation il Molecular Devices '3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E 'ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca 2 +-permeabile canali ionici e G-proteine recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca 2 + livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell'attivazione. In questo video, dimostriamo l'applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l'applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L'effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.
Protocollo
1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti
Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA
- HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%.
- Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 2....
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Discussione
Intracellulare di Ca 2 + gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d'azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca 2 + intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca 2 +-permeabile canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di
.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova per il loro supporto. Il sistema a 3 FlexStation fa parte dello strumento UTHSC Imaging Cytodynamic. Ringraziamo anche Drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell dalla Scripps Research Institute e del Genomics Institute della Novartis Research Foundation (GNF) per fornire la linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile. La ricerca è finanziata in parte dalle concessioni dal NIH (GM081658 a MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (a SS) e Mission Connect / TIRR Foundation (a SS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Beh, FlexStation Pipettare Consigli | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-ben chiaro piastre a fondo piatto | Co-star | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo, 04:00 | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poli-L-ornitina | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Albumina di siero bovino | Sigma | A9418 |
Riferimenti
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-19....
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Ristampe e permessi
