Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Sommario

Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.

Abstract

I virus sono parassiti obbligati cellulare, e quindi lo studio del loro DNA virale richiede materiale isolante lontano da agenti inquinanti e del DNA della cellula ospite. Diverse applicazioni a valle richiedono grandi quantità di puro DNA virale, che viene fornito da questo protocollo. Queste applicazioni includono il sequenziamento del genoma virale, in cui la rimozione del DNA ospite è fondamentale per ottimizzare l'output dei dati per le sequenze virali, e la produzione di nuovi ceppi virali ricombinanti, in cui la co-trasfezione del plasmide purificato e lineare facilita la ricombinazione del DNA virale. ^{1,2, 3}

Questa procedura utilizza una combinazione di estrazioni e la densità a base di centrifugazione per isolare il DNA purificato lineare herpesvirus nucleocapside dalle cellule infette. ^4,5 Le fasi iniziali di purificazione scopo di isolare purificata capsidi virale, che contengono e proteggono il DNA virale durante le estrazioni e le fasi di centrifugazione che rimuovono le proteine ​​cellulari e il DNA. Lisi delle nucleocapsidi quindi rilascia DNA virale, e due finali fenolo-cloroformio passi rimuovere le proteine ​​rimanenti. Il DNA finale catturato da una soluzione è altamente concentrato e puro, con un valore medio di 1,90 _260/280. A seconda della quantità di cellule infette utilizzati, i rendimenti della gamma DNA virale 150-800 mg o più. La purezza di questo DNA rende stabile durante conservazione a lungo termine a 4C. Questo DNA è quindi ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni.

Prima di iniziare la procedura, è importante conoscere il numero medio di cellule per piatto (ad esempio una media di 8 x 10 ⁶ PK-15 cellule in un piatto confluenti 15 cm), e il titolo dello stock virale da utilizzare ( ad esempio, 1 x 10 ⁸ unità formanti placca per ml). Queste sono necessarie per calcolare la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per il protocollo. ⁶ Per esempio, per infettare piatto da 15 cm di PK-15 celle con il brodo sopra virale, ad una MOI di 5, si usa 400 ml di magazzino virale e diluire con 3,6 ml di terreno (volume inoculazione totale di 4 ml per piastra da 15 cm).

Molteplici preparazioni di DNA virale può essere preparato allo stesso tempo. Il numero di preparati simultanea è limitata solo dal numero di tubi detenuta dal rotore ultracentrifuga (uno per ogni virus; vedi punto 3.9). Qui si descrive la procedura come se venisse fatto per un virus.

Protocollo

1. Primo Giorno: Infezione virale e preparazione del buffer

1. Preparare piatti 50-10 (15 cm di diametro) di cellule di coltura per le infezioni, ad esempio, PK-15 cellule per virus pseudorabbia (PRV) o cellule Vero per l'herpes simplex virus (HSV).
2. Quando le cellule sono 95 - confluenti al 100%, li infettano a (MOI) di 5-10. Per fare questo, inoculare ciascuna piastra con magazzino virus in un volume totale di 4 ml per piastra, incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C. Placche di roccia dolcemente ogni 15 minuti per assicurarsi che il monostrato cellulare rimane completamente rivestito con l'inoculo del virus. Nel frattempo, scaldare la media per il prossimo passo.
3. Dopo un'ora di infezione, aspirare l'inoculo virale dai piatti, aggiungere 15 ml di terreno caldo, e incubare a 37 ° C per 12-20 ore in un incubatore umidificato.
4. Preparare buffer LCM (vedi tabella 1) e rock notte a 4 ° C per omogeneizzazione della miscela. Preparare TNE per la risospensione del DNA virale (vedi Tabella 2).

2. Secondo giorno, Fase 1: la lisi cellulare e ultracentrifugazione

1. Verificare visivamente che l'infezione di cellule ha causato uniforme effetto citopatico (CPE). Consentire l'infezione al progresso finché tutte le cellule hanno arrotondato per eccesso, ma non hanno sollevato il piatto.
2. Raschiare le cellule infettate nel mezzo, e combinano le cellule e mezzo in 50 ml provette coniche. Il numero di tubi conici necessarie per questo passo dipenderà dal numero di piatti usati per l'infezione nella fase 1.2, ad esempio, un tubo da 50 ml può essere utilizzato per far sedimentare un massimo di 3 piatti a base di 15 ml di mezzo di ogni opzione:. Sciacquare il piastre con 10 ml di PBS e si combinano con le cellule e medie imprese.
3. Cellule centrifuga e medie per 10 minuti a 2000 centifugal forza relativa (RCF) a temperatura ambiente, poi aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet in 10 ml di PBS. Se il pellet da una infezione virale è stata diffusa in più tubi conici al punto 2.2, questi possono essere ricombinati in un tubo conico in questa fase. Ripetere centrifugazione e aspirazione. Optional: Questo pellet possono essere conservati a -20 ° C e il protocollo ha continuato in un secondo momento.

3. Secondo giorno, Fase 2: ultracentrifugazione

Tenere il pellet di cellule e buffer LCM sul ghiaccio, quando possibile durante le fasi seguenti.

1. Aggiungi β-mercaptoetanolo allo 0% glicerolo - buffer LCM. Iniziare il raffreddamento del ultracentrifuga (per il passo 3.9) impostandolo a 4 ° C e accendere il vuoto.
2. Risospendere il pellet in 5 ml di glicerolo 0% - buffer LCM fino a quando non è più disomogeneo. Se necessario, il tubo vortex per rompere ogni cellula indisciolto pellet.
3. Estrarre con l'aggiunta di 1,5 ml di Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vortex vigorosamente. Immediatamente centrifugare per 10 minuti a 2000 rcf ad una temperatura di 4 ° C. Raccogliere lo strato superiore con un ampio tunnel puntale (evitando l'interfaccia) e il trasferimento in una nuova provetta. Facoltativo: Se il pellet è un solido gelatinoso, si può rapidamente versare lo strato superiore in un nuovo tubo.
4. Ripetere l'estrazione Freon e centrifugare di nuovo.
5. Raccogliere lo strato superiore (~ 5 ml) e il trasferimento in una nuova provetta ultracentrifuga polyallomer. Aggiungi β-mercaptoetanolo per i restanti due glicerolo - buffer LCM.
6. Preparazione di un gradiente nella provetta da centrifuga polyallomer dal sottostante l'estratto Freon (strato superiore) con 3 ml di glicerolo al 5% - LCM (strato intermedio), sottostante e poi di nuovo con 2,5 ml di 45% glicerolo - LCM (strato inferiore). Utilizzare una pipetta sottile per evitare di overflow del contenuto della provetta.
7. Se necessario, preparare un tubo equivalente bilancia con le stesse proporzioni di buffer LCM.
8. Trasferimento tubi in secchi ultracentrifuga. Equilibrio secchi di 0,1 g di ogni altro, da dolci aggiungendo ulteriore glicerolo 0% - buffer LCM al livello superiore (~ 50-100 microlitri alla volta).
9. Utilizzando un ultracentrifuga freddo con un rotore orizzontale o oscillare, ruotare i campioni equilibrato per 1 ora a 77000 rcf (ad esempio 25.000 rpm per un rotore SW41Ti) ad una temperatura di 4 ° C.
10. Durante ultracentrifugazione, fare un gancio di vetro per catturare DNA galleggiante nel passaggio precipitazione in etanolo (4.6). Tenere entrambe le estremità di una pipetta Pasteur in vetro e sospendere la sezione centrale a fuoco. Quando una sezione del vetro è quasi fuso, tirare delicatamente per allungare il vetro, piegare delicatamente per creare un gancio ben angolato (<90 gradi), e tirare bruscamente a sbarrare la strada alla fine. Se la punta del gancio vetro è aperto, tenere la punta sulla fiamma in modo che il vetro fonde a sufficienza per chiuderla.
11. Dopo l'ultracentrifugazione, si dovrebbe vedere un sottile opaca pellet con una macchia scura al centro. Con attenzione aspirare il liquido dal tubo, tra cui colature lungo i lati, ma evitando il pellet sul fondo della provetta.
12. Aggiungere 0,5 ml di TNE a temperatura ambiente.
13. Lasciate che i pellet riposare per almeno 10 minuti per permettere l'idratazione del pellet. Optional: Il pellet può anche risospendere in TNE durante la notte, se conservato a 4 ° C.

4. Terzo Giorno: "Ghost" Precipitazione del DNA

1. Spezzare il pellet pipettando con un piccolo foro puntale (ad esempio una punta p200 pipetta). Non preoccupatevi di taglio in questa fase, perché il DNA virale è ancora contenuto in capsidi a questo punto. Aggiungere i seguenti reagenti per il tubo contenente il virale a pellet, a temperatura ambiente, di distruggere capsidi:
   • 4,25 ml TNE
   • 0,25 ml 10% SDS
   • 2 mg proteinasi K
   Agitare delicatamente per miscelare questi reagenti. Ci dovrebbe essere un leggero aumento della viscosità.

Attenzione taglio da qui in poi, ad esempio l'uso di grosso calibro pipette e non vortice del materiale virale

2. Estratto di proteine ​​virali con l'aggiunta di 5 ml di fenolo-cloroformio e iniziare immediatamente invertendo o vortex per mantenere una emulsione. Mescolare per 10 secondi, quindi l'emulsione centrifuga per 5 minuti a 2000 rcf a temperatura ambiente. Raccogliere il strato superiore con un ampio tunnel punta della pipetta, evitando l'interfaccia, e il trasferimento in una nuova provetta. Optional: Usa ad aggancio di fase gel (PLG), tubi in questa fase per evitare la contaminazione con l'interfaccia.
3. Ripetere l'estrazione fenolo-cloroformio e centrifugare di nuovo.
4. Dopo la seconda estrazione fenolo-cloroformio, raccogliere lo strato superiore in una provetta di vetro da 30 ml Corex e freddo il tubo a -20 ° C per 10-15 minuti, avendo cura che non congelare.
5. Aggiungere 10 ml di etanolo ghiacciato, coprire il tubo (ad esempio allungando un pezzo di Parafilm M sopra le righe), e miscelare immediatamente. Guardare per un DNA "fantasma" a comparire, che consiste in un precipitato ropy sottile. Capovolgere la provetta delicatamente per mescolare ulteriormente e provocare il DNA appiccicoso precipitati di raggruppare insieme.
6. Utilizzare un gancio di vetro per catturare il fantasma del DNA (s). Con attenzione macchia il DNA per eliminare il liquido in eccesso, quindi inserire il gancio (punta verso il basso) in una provetta da 1,5 ml e lasciare asciugare. Aggiungi 0,25-0,5 ml di TE per sciogliere il fantasma del DNA. Lasciare risospensione del DNA per procedere per almeno un'ora. DNA conservare a 4 ° C. Facoltativo: per massimizzare la resa del DNA, rompere il gancio di vetro nella provetta da 1,5 ml, in modo che la risospensione fuori i frammenti di vetro possa continuare nel tempo.

5. Rappresentante Risultati

Con un sufficientemente elevato MOI, le cellule devono raggiungere la piena CPE entro ~ 18 ore dopo l'infezione (HPI) per i ceppi wild-type PRV, e ~ 24 HPI di wild-type ceppi di HSV-1 (Figura 1). Una volta infettato il pellet cellulare viene raccolta, i passaggi rimanenti protocollo può essere completa in un solo giorno o svolte nell'arco di due giorni (Figura 2).

Quando si prepara ganci di vetro per catturare il fantasma del DNA, è importante per rendere l'angolo gancio essere inferiore a 90 gradi, in modo che poi si può andare bene nella base di un tubo da 1,5 ml (Figura 3). Sigillando la punta di questo gancio previene la perdita di DNA all'interno della pipetta.

Fantasmi del DNA si formano durante la fase di precipitazione e appariranno come bianco, fili filante (Figura 4). Questi aggregati e bastone tra loro e / o il gancio di vetro utilizzato per catturare il DNA. Così il gancio stesso bicchiere può essere usato per raccogliere più thread di DNA all'interno della soluzione di precipitazione.

Scegli colonna in base al volume desiderato:	10 ml	15 ml	20 ml	40 ml
1M KCL	1,3 ml	1,9 ml	2,5 ml	5 ml
1M Tris (pH 7,4)	300 ul	450 microlitri	600 microlitri	1,2 ml
1M MgCl 2	50 microlitri	75 microlitri	100 ul	200 l
0,5 EDTA	10 microlitri	15 microlitri	20 l	40 microlitri
NP40/IGEPAL	50 microlitri	75 microlitri	100 ul	200 l
β-mercaptoetanolo (aggiungere immediatamente prima dell'uso)	4,3 microlitri	6,5 microlitri	8,6 microlitri	17,2 microlitri
Utilizzare le proporzioni per cento glicerolo desiderato (0, 5 o 45%)
0% glicerolo	Nessuno	Nessuno	Nessuno	Nessuno
acqua	8,3 ml	12,5 ml	16,7 ml	33,4 ml
5% di glicerolo	0,5 ml	0,8 ml	1,0 ml	2,0 ml
acqua	7,8 ml	11,7 ml	15,7 ml	31,4 ml
45% glycerol	4,5 ml	6,8 ml	9,0 ml	18,0 ml
acqua	3,8 ml	5,7 ml	7,7 ml	15,4 ml

Tabella 1. Ricette per la preparazione di tamponi LCM

Per 50 ml

5 ml 1M NaCl

2,5 ml 1M Tris, pH 7,5

1 ml di EDTA 0,5

41,5 ml di H 2 O

Tabella 2. Preparazione di TNE (0,1 M di NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA)

Per 1 volume L

0,2 g KCl

0,2 g di KH 2 PO 4

8 g di NaCl

1.15g Na 2 HPO 4

H 2 O per 1L

Tabella 3. Preparazione del PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH ₂ PO _4; 137 mm NaCl; 8,1 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,0)

Figura 1. PK15 cellule (A) prima infezione, (B) a metà strada attraverso l'infezione, e (C) a effetto citopatico (CPE), dopo una molteplicità di infezione.

Figura 2. Panoramica del protocollo.

Figura 3. Tre esempi rappresentativi di vetro ami utilizzati per raccogliere i fantasmi del DNA virale.

Figura 4. Esempio rappresentativo di una ben formata e abbondante DNA "fantasma".

Discussione

Parti di questo protocollo sono stati originariamente sviluppati per l'isolamento del DNA virale nel BSL4 condizioni, ma si adatta altrettanto bene a non BSL condizioni. ⁴ Si comunemente utilizzano questo protocollo per isolare il DNA dalla alfa-herpesvirus PRV e HSV-1, che hanno genomi di DNA racchiuso in una capside proteica e circondato da un involucro lipidico. ^7,8 Tuttavia è probabile direttamente adattabile ad altri virus a DNA di grandi dimensioni, tra cui beta-e gamma-herpes virus e gli...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano)	Pescatore	T178-4	Chiedi al tuo istituto per le linee guida sullo smaltimento appropriato dei rifiuti contenenti freon, o vedere Mendez et al. alternative Freon potenziale 9.
Fase di bloccaggio tubi di gel, Heavy capacità di 15 ml	5 PRIME	2302850	Opzionale
Polyallomer ultracentrifuga tubi	Beckman *	331372 *	* Tubi Seleziona appropriato per il proprio ultracentrifuga; questi sono inclusi come esempio solo
NP-40 / IGEPAL	Sigma	I-3021
PK-15 cellule	ATCC	CCL-33
Cellule Vero	ATCC	CCL-81
PBS	Hyclone	SH30028.03