La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Summary

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

Abstract

Stampa microcontact fornisce un metodo rapido e altamente riproducibile per la creazione di ben definite substrati fantasia. ¹ Durante la stampa microcontact può essere impiegato per stampare direttamente un gran numero di molecole, tra cui le proteine, DNA ^{2, 3} e silani, ⁴ la formazione del sé monostrati-assemblati (SAM) dal tioli alcani a catena lunga in oro fornisce un modo semplice per limitare le proteine ​​e le cellule di specifici modelli contenenti regioni adesivo e resistente. Questo confinamento può essere utilizzato per controllare la morfologia delle cellule ed è utile per l'esame di una serie di domande di proteine ​​e di biologia cellulare. Qui, descriviamo un metodo generale per la creazione di ben definiti i modelli per lo studio delle proteine ​​cellulari ⁵ Questo processo prevede tre fasi:. La produzione di un maestro di fantasia utilizzando fotolitografia, stampa la creazione di un francobollo PDMS, e microcontatto di un oro- substrato rivestito. Una volta modellato, questi substrati di coltura cellulare sono in grado di confinare le proteine ​​e / o cellule (cellule primarie o linee cellulari) per il modello.

L'uso di auto-assemblati chimica monostrato consente un controllo preciso sulla fantasia di proteine ​​/ cella regioni adesive e non adesive regioni; questo non può essere realizzato utilizzando stampaggio diretto delle proteine. Hexadecanethiol, la lunga catena tiolo alcano utilizzato nel passaggio stampa microcontact, produce una superficie idrofoba che assorbe facilmente le proteine ​​dalla soluzione. Il glicol-terminated tiolo, utilizzato per il riempimento non stampate regioni del substrato, crea un monostrato che è resistente a proteine ​​e quindi la crescita delle cellule. ⁶ Questi monomeri tiolo produrre monostrati strutturate che definire con precisione le regioni del substrato in grado di supportare proteine ​​e la crescita cellulare. Come risultato, questi supporti sono utili per una vasta gamma di applicazioni da studio del comportamento intercellulare ⁷ alla creazione della microelettronica ^8.

Mentre altri tipi di chimica monostrato sono stati utilizzati per studi su colture cellulari, compreso il lavoro del nostro gruppo utilizzando trichlorosilanes per creare modelli direttamente su substrati di vetro, ⁹ monostrati fantasia formato da alcano tioli su oro sono straight-forward per la preparazione. Inoltre, i monomeri utilizzati per la preparazione monostrato sono disponibili in commercio, stabile, e non richiedono la conservazione o la manipolazione in atmosfera inerte. Substrati preparati con fantasia tioli alcano possono essere riciclati e riutilizzati più volte, mantenendo la reclusione cellula ^10.

Protocol

1. Preparazione del Master Patterned (Figura 1)

1. Centrare il wafer di silicio sulla spin-verniciatore e risciacquare il wafer con acetone durante la fase iniziale dei due cicli programma di centrifuga nella tabella 1. L'acetone evapora durante la seconda fase del programma di centrifuga lasciando un pulito, asciutto wafer.
2. Applicare circa 1 ml AZ9245 photoresist / a (di diametro) al wafer e spin-coat con le condizioni descritte nella tabella 1.
3. Soft-cuocere il photoresist rivestite di wafer a 110 ° C per 2 m con un alta uniforme cottura.
4. Photopattern il substrato utilizzando una diretta-scrittura sistema di fotolitografia o di ....

Discussion

Un certo numero di problemi possono insorgere nella produzione litografica del master utilizzato per la creazione timbro PDMS. Sottoesposizione di resistere rivestite risultati wafer nei modelli confusa e indistinta e sovraesposizione del resistere rivestite risultati wafer di caratteristiche ingrandita o mancanti. In generale, i maestri con dimensioni caratteristiche di grandi dimensioni (> 10 micron) sono relativamente facili da sviluppare e modello, mentre i maestri con le più piccole caratteristiche possono richi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Wafer di silicio	Wafer Reclaim Servizi		2 pollici
Spin verniciatore / piastra calda	Brewer Scienza	Cee 200CB Spin-Bake sistema
AZ9245 Fotoresist	Mays Chemical Company	105880034-1160
Diretta-scrittura fotolitografia sistema	Microtech srl	LW325 LaserWriter sistema
Maschera Aligner	HTG	3HR
AZ 400K Developer	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Kit silicone elastomero	Dow Corning
25 millimetri no. 1 coprioggetto di vetro rotondo	VWR	16004-310
Plasma Oxidizer	Diener	Femto
Titanio pezzi Kamis	Incorporated		99,95% puro
Oro pellet	Kamis Incorporated		99,999% puro
Evaporatore a fascio elettronico	Kurt J. Lesker	PVD 75 film sottile sistema di deposizione	con fascio elettronico accessorio
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglicole)	Sigma Aldrich	674508
Etanolo	Pharmco-aaper	111000200	200 prove, in assoluto
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Senza calcio e magnesio
I mouse Laminina	VWR	95036-762
Plasma umano fibronectina	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 carbossilico, succinimidile estere	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Rosso 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 carbossilico, estere succinimidile	Invitrogen	A-10168
Anticorpi anti-laminina	Fisher Scientific	AB2034MI