Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.
Articolo metodologico
Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attive 1. Composti in gabbia sono molecole fatte fisiologicamente inattivo da una gabbia chimico che può essere interrotta da un lampo di luce ultravioletta. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di composti in gabbia per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi. Il processo di trasduzione olfattiva (Figura 1) si svolge nel ciglia di neuroni sensoriali olfattivi, dove odoranti legandosi ai recettori porta all'aumento di cAMP che si apre nucleotidi ciclici (CNG) canali 2. Ingresso di Ca attraverso canali CNG attiva Ca-attivati i canali Cl. Mostriamo come dissociare i neuroni dell'epitelio olfattivo del mouse 3 e come attivare i canali CNG o Ca-attivati i canali Cl da fotolisi di cAMP in gabbia in gabbia Ca 4 o 5 </ Sup>. Noi usiamo una lampada flash 6,7 per applicare lampeggia ultravioletti alla regione ciliare di uncage cAMP o Ca mentre patch-clamp registrazioni sono prese per misurare la corrente in tutta la cellula-voltage-clamp configurazione 8-11.
Protocollo
1. Strumentazione
- Per misurare la risposta dei neuroni sensoriali olfattivi alla fotolisi di composti incapsulati, utilizziamo una lampada al flash in combinazione con un sistema tipico di registrazione in patch-clamp che comprende: un amplificatore per patch-clamp, un elettrodo di registrazione e un elettrodo di riferimento collegati alla testa dell'amplificatore per patch-clamp, un digitalizzatore, un computer, un software per l'acquisizione dei dati, micromanipolatori, un microscopio ad epifluorescenza, un sistema di perfusione, un tavolo antivibrazioni e una gabbia di Faraday (Figura 2).
- Per generare un lampo di luce ultravioletta (UV) ad alta intensità, utilizziamo una lampada al flash allo xenon (unità flash Rapp OptoElectronic JML-C2, Figura 3A) che funziona scaricando un condensatore ad alta tensione attraverso un tubo a scarica corta riempito con gas xenon6-7. Il lampo di luce può essere attivato manualmente o tramite computer, utilizzando lo stesso software che controlla l'acquisizione elettrofisiologica.
- Un filtro passa-basso UV ottimizzato per applicazioni di rilascio fotoindotto (270-390 nm) viene inserito in una fessura di uscita della lampada al flash e una guida luminosa in fibra ottica di quarzo viene collegata al microscopio (vedi punto 1.5).
- L'intensità del lampo luminoso e quindi l'entità della fotolisi possono essere modificate variando parametri specifici:
tensione o capacità6. Infatti, l'intensità della luce è legata all'energia immagazzinata nel condensatore e dipende dal valore della capacità e dalla tensione ai suoi capi, secondo la relazione standard 0.5 CV2. Uno tra tre valori di capacità può essere selezionato sul pannello frontale della nostra lampada al flash (C1=1000 μF, C2=2000 μF o C3=3000 μF) e la tensione può essere variata tra 100 e 385 Volt (Figura 3A), producendo un'energia immagazzinata compresa tra 5 e 220 J. La durata del flash varia da 0,5 a 1 ms a mezza larghezza massima e dipende dal valore di capacità selezionato. Prima di selezionare una capacità diversa o impostare la tensione a un valore inferiore, è necessario scaricare il condensatore, selezionando la modalità di scarica sul pannello frontale della lampada al flash (Figura 3A).
Tuttavia, l'energia luminosa non è semplicemente proporzionale all'energia immagazzinata a causa di molteplici fattori legati alla fisica delle scariche nei gas e alle perdite non lineari nel circuito all'aumentare dell'energia elettrica6. Per misurare l'energia associata a un lampo di luce, si può utilizzare un joulemetro, come il modello JM10 fornito da RappOptoElectronics. Si noti che l'energia in uscita dalla guida luminosa in quarzo con filtro UV inserito è nell'intervallo 1-15 mJ per flash, come riportato nel manuale utente dell'unità flash Rapp OptoElectronic.
Un'unità fotodiodo (Figura 3B) è fornita insieme all'unità lampada al flash e può essere utilizzata per stimare le variazioni dell'intensità luminosa in funzione di C e V. Infatti, l'uscita del fotodiodo è proporzionale all'intensità della luce. Seguendo le istruzioni del manuale utente, la guida luminosa viene collegata all'ingresso dell'unità fotodiodo, mentre l'uscita viene collegata a un oscilloscopio. La Figura 3C mostra la tensione di picco in uscita dal fotodiodo in risposta ai lampi di luce per i tre valori di capacità C1, C2 o C3 disponibili nella nostra unità lampada al flash, in funzione della tensione applicata. Questi valori cambiano con l'invecchiamento della lampadina del flash. È buona norma utilizzare regolarmente il fotodiodo per verificare il degrado della lampadina del flash.
Invece di modificare la capacità e/o la tensione sul pannello frontale, un controllo più preciso e rapido dell'intensità luminosa si ottiene posizionando filtri neutri in una seconda fessura del filtro della lampada al flash (Figura 3A). Questo approccio è più rapido e inoltre non modifica la durata del flash, che dipende dal valore di capacità selezionato. Utilizzando filtri neutri con trasmissione compresa tra il 100% e lo 0,1%, l'intensità del flash può essere modificata rapidamente su un ampio intervallo. - Il lampo di luce viene indirizzato al neurone, coltivato su piastre con fondo in vetro, attraverso una guida luminosa in fibra ottica di quarzo (Figura 2). La guida luminosa viene collegata all'attacco per epifluorescenza del microscopio invertito mediante un adattatore. Un cubetto filtro modificato, privo di filtro di eccitazione, indirizza il fascio UV al neurone tramite uno specchio dicromatico.
- La luce viene focalizzata attraverso un obiettivo ad immersione in olio da 100x. L'area coperta dal lampo viene visualizzata inserendo la guida luminosa in un illuminatore che fornisce una sorgente continua di luce visibile. L'immagine (rappresentata in giallo nel video) viene visualizzata su un monitor tramite una telecamera CCD collegata al microscopio. Il contorno dell'area illuminata viene disegnato sul monitor per localizzare l'area del flash UV negli esperimenti. Prima di erogare il flash UV, la regione ciliare del neurone viene posizionata all'interno dell'area disegnata sul monitor.
- Le dimensioni del punto di luce UV sono controllate dall'ingrandimento dell'obiettivo, dal diametro della guida luminosa e dalla posizione della guida luminosa sul retro del microscopio. Utilizziamo un obiettivo ad immersione in olio con ingrandimento 100x. Il diametro del punto circolare viene misurato indirizzando la luce da un illuminatore su una piastra micrometrica posizionata sul piano del microscopio. Il diametro del punto nel nostro apparato è approssimativamente di 16, 33, 50 o 105 μm per una guida luminosa con diametro rispettivamente di 200, 400, 600 o 1250 μm.
2. Preparazione delle soluzioni
Dissezione
- Soluzione di Ringer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosio, 1 mM piruvato di sodio (pH 7,4 aggiustato con NaOH 1 M).
- Soluzione di arresto: soluzione di Ringer con 0,1 mg/ml di BSA, 0,3 mg/ml di leupeptina e 0,02 mg/ml di DNaseI.
- Soluzione di Ringer senza ioni bivalenti: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucosio, 1 mM piruvato di sodio (pH 7,4 con NaOH 1 M). Aggiungere 200 μM cisteina e 2 U/ml di papaina per la dissociazione enzimatica.
Nota: filtrare sterilmene le soluzioni destinate alla dissezione.
Soluzioni per la registrazione con tecnica patch-clamp
Soluzioni extracellulari
- Soluzione Ringer extracellulare: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosio, 1 mM piruvato di sodio (pH 7,4 aggiustato con NaOH 1 M).
- Soluzione Ringer a basso contenuto di Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosio, 1 mM piruvato di sodio (pH 7,4 aggiustato con NaOH 1 M).
Soluzioni intracellulari
Preparare e utilizzare sempre le soluzioni di composti fotoprotetti in luce fioca per evitare il degrado dei composti fotoprotetti causato dalla luce ambientale. Proteggere i contenitori dalla luce avvolgendoli con carta d'alluminio.
cAMP incapsulato:
- Preparare una soluzione intracellulare contenente 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP e 0,1 mM NaGTP (pH 7,4 aggiustato con KOH 1 M).
- Preparare una soluzione madre sciogliendo il cAMP incapsulato (BCMCM-cAMP4) in DMSO a 50 mM. Preparare aliquote da 5 μl. Conservare fino a un anno a -20°C.
- Sciogliere un’aliquota della soluzione madre di cAMP incapsulato nella soluzione intracellulare per ottenere una concentrazione finale di 50 μM di cAMP incapsulato. Mescolare utilizzando un vortex.
- Preparare aliquote da 1 ml della soluzione intracellulare con cAMP incapsulato. Conservare fino a due mesi a -20°C fino all’uso.
Calcio incapsulato:
Prepariamo soluzioni intracellulari contenenti DMNP-EDTA 3 mM5 caricate al 50% con Ca 1,5 mM.
- Preparare una soluzione intracellulare contenente 140 mM KCl (o CsCl), 10 mM HEPES (pH 7,4 aggiustato con 1M KOH o CsOH).
- Aprire una provetta contenente 5 mg di DMNP-EDTA. Aggiungere 52,8 μl di una soluzione standard di cloruro di calcio 0,1 M e 1 ml di soluzione intracellulare. Mescolare utilizzando un vortice.
- Per evitare l'uncaging del calcio caged causato dalla luce ambiente, trasferire la soluzione in una provetta protetta dalla luce con carta d'alluminio. Aggiungere soluzione intracellulare fino a raggiungere un volume finale di 3,5 ml. Mescolare utilizzando un vortice. Preparare aliquote di circa 1 ml della soluzione intracellulare con calcio caged e conservarle fino a due mesi a -20°C fino all'uso.
Nota: Durante gli esperimenti, proteggere le soluzioni di composti caged dalla luce utilizzando carta d'alluminio e mantenerle sul ghiaccio. Filtrare in modo sterile la soluzione intracellulare.
3. Dissociazione dei neuroni sensoriali olfattivi del topo
Gli animali sono stati trattati in conformità con le Linee Guida Italiane per l'Uso degli Animali da Laboratorio (Decreto Legislativo 27/01/1992, n. 116) e con le linee guida dell'Unione Europea sulla sperimentazione animale (n. 86/609/CEE).
- Preparare tre piastre con fondo in vetro rivestite con concanavalina-A 10 mg/ml e poli-L-lisina 10 mg/ml.
- Per prepararsi alla dissezione, preparare 1 ml di soluzione di Ringer priva di ioni bivalenti. Riempire due piastre di Petri da 50 mm rivestite con Sylgard con la soluzione di Ringer e porle sul ghiaccio. Raffreddare anche una miscela di papaina-cisteina, 0,5 ml della soluzione di arresto e una siringa con filtro da 0,22 μm contenente circa 10 ml di soluzione di Ringer.
- Sacrificare un topo mediante asfissia con CO2 seguita da decapitazione. Rimuovere la cute sovrastante il cranio, tagliare lungo le linee della mascella e posizionare la testa in una piastra di Petri rivestita con Sylgard.
- Posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzando un bisturi, dividere sagittalmente la testa lungo la linea mediana. Ruotare metà della testa con il lato mediale verso l'alto. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i turbinati (vedere anche Cygnar et al., 201013).
- Utilizzando pinzette n. 3 e un bisturi, rimuovere i turbinati rivestiti con l'epitelio olfattivo. Trasferirli in una piastra di Petri rivestita con Sylgard.
- Utilizzando pinzette finissime n. 55, separare i frammenti di epitelio olfattivo dalle parti aderenti dei turbinati. Trasferirli in un tubo contenente 1 ml di soluzione di Ringer priva di ioni bivalenti. Aggiungere la miscela di papaina e cisteina. Triturare l'epitelio con forbici microchirurgiche e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti. Triturare nuovamente delicatamente con le forbici microchirurgiche e attendere altri 5 minuti.
- Utilizzando una pipetta di Pasteur lucidata alla fiamma, trasferire in un tubo contenente 0,5 ml di soluzione di arresto.
- Centrifugare a 300 g (1500 RPM) per 5 minuti. Eliminare il soprannatante e aggiungere circa 1 ml di soluzione di Ringer filtrata. Triturare delicatamente con una pipetta di Pasteur lucidata alla fiamma.
- Piastrare circa 0,3 ml della soluzione contenente le cellule al centro delle tre piastre con fondo in vetro. Lasciare sedimentare le cellule per circa un'ora a +4°C. Aggiungere soluzione di Ringer.
4. Registrazione
- Preparare le pipette per il patch-clamp da capillari in borosilicato in modo da ottenere resistenze di 3-7 MΩ quando riempite con soluzione intracellulare.
- Posizionare una piastra con fondo in vetro contenente i neuroni sensoriali olfattivi dissociati sul palchetto del microscopio invertito. Perfundere con soluzione di Ringer.
- Proteggere con carta d'alluminio una siringa contenente la soluzione intracellulare con composti incapsulati e mantenerla in frigorifero. Lavorare in luce fioca per evitare la degradazione dei composti incapsulati dovuta alla luce ambientale.
- Cercare un neurone sensoriale olfattivo isolato con ciglia integre a un ingrandimento di 100x. Spostare il palchetto del microscopio per posizionare la regione ciliare all'interno del cerchio disegnato sul monitor, in modo da localizzare l'area precedentemente identificata per il lampo UV.
- Riempire una pipetta per il patch-clamp con la soluzione intracellulare contenente il composto incapsulato utilizzando un ago flessibile. Rimuovere le bolle dalla punta della pipetta. Inserire la pipetta nel supporto sulla testa del microscopio del registratore per patch-clamp. Avvicinarsi al soma del neurone utilizzando il micromanipolatore ed applicare una leggera aspirazione per ottenere un sigillo di gigaohm. Impostare la tensione a -60 mV ed applicare ulteriore aspirazione per raggiungere la modalità whole-cell utilizzando tecniche standard di patch-clamp12.
- Attendere almeno due minuti per consentire la diffusione del composto incapsulato all'interno delle ciglia.
- Sul computer avviare un protocollo di stimolazione e registrare la risposta. Utilizzare un filtro passa-basso a 1 kHz e digitalizzare con una frequenza di campionamento di almeno 2 kHz.
- Un protocollo di stimolazione tipico mantiene la tensione a un valore costante e attiva il rilascio di un lampo UV dalla lampada al flash per la fotolisi del composto incapsulato nella regione ciliare.
5. Risultati rappresentativi:
Dovresti essere in grado di produrre un'uncaging localizzata di cAMP incapsulato o di Ca incapsulato nella regione ciliare di un neurone sensoriale olfattivo isolato e registrare la risposta in corrente nella configurazione di voltage-clamp in whole-cell.
La Figura 4 mostra una corrente entrante tipica provocata da un lampo UV che induce la fotolisi del cAMP incapsulato, registrata a una tensione di -60 mV in presenza di una soluzione extracellulare di Ringer a bassa concentrazione di Ca. In queste condizioni, la corrente entrante è dovuta all'ingresso di Na attraverso i canali CNG. La fase crescente della corrente è stata rapida ed è stata approssimata con una funzione esponenziale singola con una costante di tempo di 3,4 ms.
Le figure 5A-B mostrano le risposte di un altro neurone sensoriale olfattivo in soluzione con Ca basso e in soluzione di Ringer con Ca 1 mM. La fase ascendente della corrente a -60 mV è diventata molto più lenta e multifasica (Figure 5 A-B). Ciò è dovuto all'azione del Ca che entra nei cigli attraverso i canali CNG e attiva una corrente secondaria di Cl10. La componente cationica precoce della corrente, dovuta all'attivazione dei canali CNG, è minore nella soluzione di Ringer con 1 mM di Ca rispetto alla soluzione con Ca basso a causa del blocco indotto dagli ioni Ca permeanti che riducono la corrente complessiva.
Un altro modo per ridurre l'aumento di Ca nelle ciglia è quello di bloccare il neurone a +60 mV (Figura 5 C-D). La fase ascendente della risposta dovuta all'uncaging di cAMP a +60 mV è stata ben descritta da un'esponenziale singola con una costante di tempo di 6,7 ms, indicando la presenza di un solo componente della corrente.
Fotoliberando Ca all'interno delle ciglia di un neurone sensoriale olfattivo, si dovrebbe essere in grado di misurare una corrente che aumenta rapidamente. Questa corrente è trasportata da ioni Cl. La figura 6 A mostra correnti entranti a -50 mV indotte dalla fotoliberazione di Ca incapsulato in risposta a lampi UV di diverse intensità. La fase di salita delle correnti di Cl attivate dal Ca è stata ben descritta da un'esponenziale singola con costanti di tempo comprese tra 3,8 e 5 ms (figura 6 B).
Figura 1. Trasduzione olfattiva nelle ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi. Le molecole odorose si legano ai recettori odorosi (OR), attivando una proteina G che a sua volta attiva l'adenilato ciclasi (ACIII), determinando un aumento intracellulare di cAMP. Il cAMP apre i canali attivati da nucleotidi ciclici (CNG), permettendo l'ingresso di ioni Na e Ca. L'aumento del Ca intracellulare attiva i canali del Cl attivati dal Ca. Il cAMP incapsulato o il Ca incapsulato possono essere introdotti nelle ciglia per diffusione attraverso una pipetta per il patch-clamp. Un lampo di luce UV induce la fotolisi del composto incapsulato (modificato, con autorizzazione, da Pifferi et al. 20062).
Figura 2. Sistema di registrazione con patch-clamp e fotolisi a lampo. I componenti dell'allestimento includono un amplificatore per patch-clamp, un computer, un digitalizzatore, un microscopio ad epifluorescenza, una lampada al xenon, una telecamera CCD e un monitor. Le linee blu e viola indicano rispettivamente il percorso della luce visibile e della luce UV.
Figura 3. Lampada allo xenon con lampo. (A) Sorgente luminosa utilizzata per la fotolisi a lampo di composti incapsulati. (B) Modulo fotodiodo utilizzato per valutare l'intensità del lampo luminoso. (C) La guida luminosa della lampada a lampo è stata collegata all'ingresso del fotodiodo e l'uscita è stata visualizzata su un oscilloscopio. Uno dei tre valori di capacità disponibili (C1, C2 o C3) è stato selezionato tramite l'interruttore sul pannello frontale della lampada a lampo e la tensione è stata modificata ruotando la manopola sul pannello frontale. La tensione in uscita dal fotodiodo in risposta a diverse intensità di lampo è stata riportata in grafico in funzione della tensione applicata per ciascun valore di capacità: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF o C3 = 3000 μF. È stata utilizzata una guida luminosa con diametro di 600 μm.
Figura 4. Registrazione con patch-clamp in risposta alla fotolisi di cAMP incapsulato in soluzione extracellulare con bassa concentrazione di Ca. (A) Risposta della corrente in tutto il cellula indotta in un neurone sensoriale olfattivo isolato mediante fotolisi di cAMP incapsulato localizzato nei cigli. Un lampo di luce ultravioletta è stato rilasciato al momento indicato dalla freccia. Il potenziale di clamping era di -60 mV. (B) La fase di crescita della corrente è stata ben approssimata con una funzione esponenziale singola (linea tratteggiata) con una costante di tempo di 3,4 ms.
Figura 5. Risposte in corrente indotte dalla fotolisi di cAMP incapsulato in soluzione con bassa concentrazione di Ca e in soluzione Ringer. (A) Un neurone sensoriale olfattivo è stato immerso in soluzione Ringer contenente 1 mM di Ca o in soluzione con bassa concentrazione di Ca, a un potenziale di clamping di -60 mV. Un lampo di luce ultravioletta è stato applicato al momento indicato dalla freccia. (B) Le risposte in corrente, riportate su scala temporale espansa, hanno mostrato una fase di salita multifasica in soluzione Ringer, mentre la fase di salita è stata ben approssimata da una funzione esponenziale singola (linea tratteggiata) con una costante di tempo di 3,5 ms per la risposta registrata in soluzione con bassa concentrazione di Ca. (C) Risposte in corrente dello stesso neurone mostrato in (A), immerso in soluzione Ringer a potenziali di clamping di -60 e +60 mV. (D) Le risposte in corrente, riportate su scala temporale espansa, hanno mostrato una fase di salita multifasica a -60 mV, mentre a +60 mV la fase di salita è stata ben approssimata da un'esponenziale singola con costante di tempo di 6,7 ms (linea tratteggiata).
Figura 6. Risposte alla fotolisi del calcio incapsulato. (A) Correnti in configurazione whole-cell indotte dalla fotolisi del calcio incapsulato a -50 mV. I lampi UV sono stati rilasciati al tempo indicato dalla freccia. L'intensità dei lampi è stata variata mediante filtri neutri. (B) Scala temporale espansa che mostra l'aumento rapido della corrente dopo il rilascio fotoindotto del calcio. Le correnti sono state ben approssimate da una funzione esponenziale singola (linee tratteggiate), con costanti di tempo di 5, 4.8, 3.8 ms. (Riprodotto, con autorizzazione, da Boccaccio & Menini, 200710).
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Discussione
Flash fotolisi di composti in gabbia in combinazione con registrazioni patch-clamp è una tecnica utile per ottenere salti rapidi e locali della concentrazione di molecole attive fisiologicamente sia all'interno che all'esterno delle cellule. Diversi tipi di compounds1 in gabbia sono stati sintetizzati, e questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di cellule, comprese le cellule in coltura esprimono canali ionici che possono essere attivate o modulata da fotolisi di alcuni dei composti disponibili in gabb...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzatura | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Adattatore modulo flash della lampada al microscopio | Rapp optoelettronici | FlashCube 70 | |
| Air tavolo | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitalizzatore | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Acquisizione Dati Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Software per l'analisi dei dati | WaveMetrics | Igor | |
| Specchio per il modulo adattatore | Rapp optoelettronici | M70/100 | |
| Elettrodo titolare | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Gabbia di Faraday | Una soluzione su misura | ||
| Cubo filtro | Olimpo | U-ULU | Filtro di eccitazione rimosso |
| Flash lampada | Rapp optoelettronici | JML-C2 | |
| Pinza Dumont # 55 | Mondo Strumenti di precisione | 14099 | |
| Vetro capillari | Mondo Strumenti di precisione | PG10165-4 | |
| Con fondo di vetro piatto | Mondo Strumenti di precisione | FD35-100 | |
| Illuminatore | Olimpo | Evidenziare 3100 | |
| Microscopio invertito | Olimpo | IX70 | |
| Micromanipolatori | Luigs & Neumann | SM Mi | |
| Micropipetta Puller | Narishige | PP-830 | |
| Controllare | HesaVision | MTB-01 | |
| I filtri a densità neutra | Omega Optical | varia | |
| Obiettivo 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Sia Zeiss o Olympus |
| Obiettivo 100X | Olimpo | UPLFLN 100XOI2 | Sia Zeiss o Olympus |
| Ottica UV shortpass filtro | Rapp optoelettronici | SP400 | |
| Patch-clamp amplificatore | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp optoelettronici | PDA | |
| Quarzo luce guida | Rapp optoelettronici | varia | Usiamo 600 micron di diametro |
| In filo d'argento | Mondo Strumenti di precisione | AGT1025 | |
| Argento terreno pellet | Warner strumenti | 64-1309 | |
| Lampada ad arco allo xeno | Rapp optoelettronici | XBL-JML |
| Reagente | Azienda | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| BCMCM-gabbia cAMP | Biolog | B016 |
| Sieroalbumina bovina (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 soluzione standard di 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cisteina | Sigma | C9768 |
| Concanavalina Un tipo V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAsi I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucosio | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptina | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papaina | Sigma | P3125 |
| Poli-L-lisina | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Riferimenti
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
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