Derivazione efficiente dei diritti dell'uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Sommario

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Abstract

Fino ad oggi, la mancanza di una adeguata fonte di cellule cardiache umane è stata la battuta d'arresto importante nella rigenerazione del miocardio umano, sia a base di cellule staminali ematopoietiche o da ^1-3 ingegneria dei tessuti cardiaci. Cardiomiociti diventano terminali differenziati subito dopo la nascita e perdono la loro capacità di proliferare. Non ci sono prove che cellule staminali / progenitrici derivate da altre fonti, come il midollo osseo o il sangue del cordone ombelicale sono in grado di dare origine alle cellule contrattili del muscolo cardiaco in seguito al trapianto nel cuore ^1-3. La necessità di rigenerare o riparare il muscolo cardiaco danneggiato non è stato raggiunto con la terapia con cellule staminali adulte, sia endogena o tramite la consegna delle cellule ^1-3. Le cellule umane geneticamente stabili staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di espansione illimitata e plasticità illimitata, porge un serbatoio pluripotenti per la derivazione in vitro di grandi quantità di cellule somatiche umane che sono limitate al lignaggio nel bisognodi riparazione e rigenerazione ^4,5. A causa della prevalenza delle malattie cardiovascolari in tutto il mondo e acuta mancanza di organi, c'è un interesse intenso hESC terapie a base di sviluppo come un approccio alternativo. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di cancerogenicità ^6-8 (vedere uno schema a fig. 1A). Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specialiinnesti di Zed nei pazienti problematici ^9-11. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sostenere la epiblast pluripotence di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole ¹² (vedere uno schema in figura. 1B). Dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso nicotinamide (NAM) sufficiente a indurre le specifiche del cardiomesoderm diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al cardioblasts cardiomiociti umani che ha generato battendo ad alta efficienza (fig. 2 ). Abbiamo definito le condizioni per l'induzione di cardioblasts diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di ungrande disponibilità di cellule cardiache per tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

Protocollo

1. Soluzione e Media Preparazione

1. Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH ₂ O, autoclave e conservare a 4 ° C.
2. Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
3. Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con ghiaccio freddo o DMEM DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
4. Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C.
5. Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell'uso. O la sostituzione di "KO sostituzione siero" con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM aminoacidi essenziali (MEAA , 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l'insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell'uso.
6. Mezzi di differenziazione cardiaca HESC: DMEM/F12 (90%), FBS definita (10%), e L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm).
7. Supporti contenenti nicotinamide (NAM): aggiungere NAM ai media HESC o supporti differenziazione HESC cardiaco a una concentrazione finale di 10 mm, filtrato, conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 2 settimane di preparazione.

2. Lastra di rivestimento

1. Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato.
2. Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte.

3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite

1. Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione.
2. Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto> 75% hESC indifferenziato (smtutte le cellule compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo definito sotto il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro.
3. Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF.
4. Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.
5. Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme.
6. Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / h beneCES supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO _2.

4. Induzione cardiaco di hESC in Sistema Cultura definita con Nicotinamide

1. Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamide (NAM).
2. Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mm NAM a giorni alterni, e permettere cardiaca indotta colonie hESC crescere a 8-10 giorni. Su esponendo a NAM, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumentano di dimensione, e di 8-10 giorni, und cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie.

5. Continuando differenziazione cardiaca in Cultura Sospensione

1. Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro.
2. Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF).
3. Tagliare il cardiaca indotta colonie hESC in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.
4. Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme.
5. Aliquota 4 ml / pozzetto senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) per formare per 4-5 giorni.

6. Battere Maturazione Cardiomyocyte fenotipo in Cultura adesivo

1. Piscina i supporti contenenti cardioblasts galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di mezzi freschi differenziazione hESC cardiaco contenente 10 mM NAM.
2. Pipetta su e giù per miscelare cardioblasts galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire cardioblasts di allegare tutta la notte.
3. Sostituire i media differenziazione cardiaca hESC contenente 10 mM NAM a giorni alterni.
4. Al giorno 8, sostituire con i media differenziazione hESC cardiaco senza NAM, e continuano a sostituire HESC cardiaca media e differenziazionegiornata molto altro. Cardiomiociti battendo cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM e aumentare di numero col tempo, e avrebbe potuto mantenere forti contrazioni ritmiche e per oltre 3 mesi.

7. Rappresentante dei risultati:

Nicotinamide (NAM) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo cardiomesodermal (Fig. 2B). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a NAM, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che down-regolano l'espressione di Oct-4 e cominciare a esprimere il fattore di trascrizione cardiaci specifici (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, in linea con un fenotipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Queste cellule differenziate continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumentano di dimensione. Aumentata intensità di Nkx2.5 saràsi osservano di solito nelle aree delle colonie in cui le cellule iniziano ad accumularsi (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC NAM trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) in una cultura sospensione per continuare il processo di differenziazione cardiaca. Dopo permettendo cardioblasts di allegare e di continuare a trattare con NAM per 1 settimana, battendo cardiomiociti cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso (Fig. 2C). Cellule all'interno dei cluster battendo cardiomiociti esprimerà marcatori caratteristici dei cardiomiociti, tra cui Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). Le contrazioni dei cardiomiociti battere sono stati confermati da profili elettrici di essere forte, ritmico, ben coordinato, e ben trascinato, con impulsi regolari che ricorda il p-QRS-T-complessi visto da elettrodi di superficie corporea in elettrocardiogrammi clinica (Fig. 2C, vedi anche il video). I cardiomiociti potrebbero mantenere il loro contrattilità forte per oltre 3 mesi.

Figura 1. Schemi complessiva di approccio convenzionale rispetto a piccole molecole-induzione approccio per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti verso cellule specializzate funzionale. (A) Uno schema di approccio convenzionale con multi-lineage inclinazione di cellule staminali umane pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale. (B) Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole.

Figura 2. Nicotinamide induce specifiche cardiaco discendenza diretta di pluripotenza in determinate condizioni e la progressione verso battendo cardiomiociti. (A) Schema raffigurante la linea temporale del protocollo di regia differenziazione cardiaca di hESC. (B) Dopo l'esposizione di hESC indifferenziato di Nicotinamide (NAM) nell'ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all'interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo. NAM-indotta delle cellule ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso), in linea con primi differenziazione cardiaca. Intensità progressivamente aumentato di Nkx2.5 era di solito osservata nelle aree della colonia in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. Tutte le cellule sono indicati da colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) NAM-indotta cardiaco impegnati hESC prodotto cardiomiociti battendo con un drastico aumento dell'efficienza, come valutato dal cellulare clusparametri che visualizzate contrazioni ritmiche (guarda il profilo elettrofisiologiche e il video), e immunopositive per Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso). Immagini fase di cluster di grandi dimensioni rappresentante battendo cardiomiociti e le immagini di potenza superiore del rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci sono indicati (vedi anche il video corrispondente). Le frecce indicano il grande grappolo cardiomiociti battendo utilizzato per la registrazione elettrofisiologica. Profilo elettrofisiologica del cardiomiociti battere spettacoli regolari, trascinato, impulsi ritmici ricorda il p-QRS-T-complessi visto in elettrocardiogrammi clinica. Barre di scala: 0,1 mm.

Video: Amministrazione cardiomiociti differenziati da NAM-indotta hESC. Video 1 e 2 video rappresentativi mostrano grande battendo cluster cardiomiociti in circa 1 e 3 mesi dopo l'attacco. Video 3 e 4 mostrano rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci a più alto potere. 5 mostra una typical piccolo gruppo cardiomiociti battere spontaneamente differenziata da hESC senza trattamento NAM come controllo.

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Discussione

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-lignaggio fase aggregata, in hESC derivati ​​multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali), solo una piccola frazione di cellule (<2%) spontaneamente differenziarsi in cardiomiociti ^13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguito, le popolazioni arricchite di cardiomiociti stati in grado di fungere da pacemaker biologico per salvare la funzione di un miocardio danneggiato meccanicamente ed elettronicamente dopo l'iniezione nel cuore di modelli animali ^13. In modelli di roditori infartuata, radicato hESC derivati ​​progenie cardiaco sono stati in grado di sopravvivere e maturare fino a 12 settimane, e parzialmente remuscularizzare il cuore ferito e migliorare la funzione contrattile ^14,15. Tuttavia, l'inefficienza nella generazione di umani impegnati cellule cardiache attraverso multi-lignaggio differenziazione delle cellule pluripotenti e l'alto rischio di cancerogenicità a seguito di trapianto hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Sviluppare strategie per incanalare l'ampio potenziale di differenziazione hESC pluripotenti esclusivamente e prevedibile di un fenotipo cardiaco è fondamentale per sfruttare la potenza di biologia hESC in campo cuore. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1B). Abbiamo scoperto che nicotinamide indotto cardio-lignaggio impegno diretto da phESC luripotent sotto cultura definita che ulteriormente progredita per battere cardiomiociti ad alta efficienza (Fig. 2). Nkx2.5 è evolutivamente conservata fattore di trascrizione homeobox indispensabile per il normale sviluppo cardiaca e le mutazioni del gene sono associate a malattie cardiache congenite umane (CHD), il difetto più comune nascita umana ^16. Espressione di Nkx2.5 è il primo marcatore di cellule precursori cuore in tutti i vertebrati finora esaminato ed è essenziale per una corretta septation cardiaco e la formazione / maturazione del sistema di conduzione elettrico ^16. Nei vertebrati, l'inizio e il modello di inizio Nkx2.5 espressione o meno coincidere con i tempi e l'area di specifica cardiache in embriogenesi precoce e Nkx2.5 gene continua ad essere espressa attraverso lo sviluppo nel cuore ^16. Nel nostro modello hESC, NAM è apparso per attivare l'induzione cardiaco diretto da hESC pluripotenti, promuovendo l'espressione di cardio-specifica transcriPZIONE Nkx2.5 fattore in un processo che potrebbe emulare le specifiche del cardiomesoderm dal epiblast pluripotenti umane in cardiogenesis embrionale. Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo cuore umano come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento NAM, hESC <2% sarà oggetto di differenziazione spontanea in cardiomiociti battendo ^12-15. Con il trattamento NAM, siamo stati in grado di generare> 95% precursori embrionale cardiomiociti battito cardiaco e> 50% da hESC mantenuto nell'ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano cuore ^12. Recentemente, noto cardio-destino geni determinanti sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo in cardiomiociti battendo post-natale, con una bassa efficienza di <0,5% ^{17, 18 <}/ Sup>. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l'espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica ^19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana ^4,5, possono non applicare alle cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivato da morula precedente (otto cellule)-stadio embrioni ^22, e le cellule riprogrammate artificialmente ^23.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Gelatina	Sigma	G1890
Matrigel	Bioscienze BD	356231	Fattore di crescita ridotta
Umano laminina	Sigma	L6274
Nicotinamide	Sigma	N0636
DMEM/F12	Invitrogen	10565042
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out sostituzione siero	Invitrogen	10828028
MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM soluzione di aminoacidi (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Acido ascorbico	Sigma	A4403
Transferrina umana	Sigma	T8158
BFGF umano	Peprotech	AF-100-18B
L'insulina umana	Invitrogen	12585014
Un umano activina	Peprotech	120-14E
FBS definito	Hyclone	SH30073-03
6-ben ultrabassa piastra di fissaggio	Corning	3471
6 pozzetti	Corning	3516