Tradizionale, bidimensionale tecniche di coltura cellulare spesso sfociano in caratteristiche alterate rispetto ai marcatori di differenziazione, citochine e fattori di crescita. Tridimensionale di coltura cellulare nel sistema delle cellule di rotazione cultura (CCR) ristabilisce l'espressione di molti di questi fattori, come illustrato qui con una linea di cellule extravilloso trofoblasto.
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Articolo metodologico
Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il campo di ricerca trofoblasto umano aiuta a comprendere il complesso ambiente stabilito durante placentazione. A causa della natura di questi studi, umano nella sperimentazione in vivo è impossibile. Una combinazione di colture primarie, culture espianto e linee cellulari trofoblasto 1 supporto la nostra comprensione di invasione della parete uterina 2 e rimodellamento delle arterie spirali uterine 3,4 da parte delle cellule del trofoblasto extravilloso (EVTS), che è richiesto per la costituzione di successo della gravidanza. Nonostante la ricchezza di conoscenze scaturite da tali modelli, si accetta che in modelli di coltura cellulare in vitro utilizzando EVT-come linee cellulari visualizzare alterato proprietà cellulari rispetto alle loro controparti in vivo 5,6. Cellule in coltura delle cellule nel sistema di rotazione cultura (CCR) visualizzare le proprietà morfologiche, fenotipiche e funzionali di EVT-come linee cellulari che più da vicino imitano differenziare in uEVTS Tero, con aumentata espressione di geni che mediano l'invasione (ad esempio metalloproteinasi della matrice (MMP)) e la differenziazione trofoblasto 7,8,9. Il Saint Georges Hospital cellula placentare Linea-4 (SGHPL-4) (gentilmente donato dal Dr. Guy Whitley e il dottor Judith Cartwright) è un EVT-come linea cellulare che è stato utilizzato per la sperimentazione in RCC.
Il progetto della nave cultura RCC si basa sul principio che organi e tessuti funzione in una tridimensionale (3-D) dell'ambiente. A causa delle condizioni di coltura dinamica della nave, comprese le condizioni di taglio fisiologicamente rilevanti, cellule cresciute in tre dimensioni, la forma aggregati sulla base di affinità naturale cellulare e di differenziarsi in tessuti come organotipica assemblee 10,11,12. Il mantenimento di un orbita fluido fornisce un basso taglio, a bassa turbolenza ambiente simile alle condizioni presenti in vivo. Sedimentazione delle cellule in coltura, si contrappone regolando la rotazionevelocità del RCC di assicurare una costante caduta libera delle cellule. Scambio dei gas avviene attraverso una membrana idrofobica permeabile trova sul retro del bioreattore. Come i loro genitori tessuti in vivo, RCC-grown cellule sono in grado di rispondere ad agenti chimici e pendenze molecolare in tre dimensioni (vale a dire la loro superficie apicale, basale e laterale) perché sono colto sulla superficie delle perline microcarrier porosa. Quando coltivate come bidimensionali monostrati su superfici impermeabili come plastica, le celle sono privati di questa importante comunicazione a loro superficie basale. Di conseguenza, i vincoli spaziali imposti dall'ambiente profondamente influenzano il modo in senso cellule e decodificare i segnali dal microambiente circostante, ciò implica un ruolo importante per l'ambiente 3-D 13.
Abbiamo usato il RCC di ingegnere biologicamente significativi modelli 3-D dei vari tessuti epiteliali 7,14,15,16. Infatti, molte relazioni precedenti demonstrated che le cellule coltivate in RCC può assumere fenotipi fisiologicamente rilevanti che non sono stati possibili con altri modelli 10,17-21. In sintesi, la cultura nel RCC rappresenta un modo semplice, riproducibile, high-throughput piattaforma che offre un gran numero di cellule differenziate che sono riconducibili a una serie di manipolazioni sperimentali. Nel seguente protocollo, utilizzando EVTS come esempio, si descrivono chiaramente i passaggi necessari per tridimensionalmente cellule aderenti cultura nel RCC.
Protocollo
1. Collagene Bead Preparazione
- Prima di EVTS di carico per 3-D di coltura cellulare, si ha la necessità di preparare il Cytodex-3 perle microcarrier:
- Pesare la quantità appropriata di Cytodex-3 perline richieste per l'esperimento. Questo protocollo è stato adattato per la nave 10ml RCC, in cui 0.05g di perline sono necessari. Per una nave da 50 ml RCC, scala di conseguenza. In un tubo 50mL autoclavabile conica, miscelare 250 mg Cytodex-3 perle con fosfato 12mL soluzione tamponata Dulbecco (DPBS). Questa quantità è sufficiente per 5 vasi RCC.
- Garantire un adeguato volume è presente nel tubo conico, come il processo in autoclave ....
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Discussione
La tecnica di cultura qui presentata fornisce investigatori altamente invasiva EVT-come le cellule. Ora è stato riconosciuto che una perdita di differenziazione avviene in monostrati a causa dell'inibizione della risposta cellulare ad agenti chimici e spunti molecolare in tre dimensioni (superficie delle cellule apicali, basali e laterali), 10,13. Questa tecnica riflette le caratteristiche indicate in utero a invadere le cellule EVT. Poiché la procedura imita convenzionale monostrato tessuto cine.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health statunitensi concedere NIH / NICHD # HD051998 (per CAM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Cytodex microcarrier perline | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotazione Cultura Cell System (CCR) | Synthecon | RCC-D | Include rotore di base, alimentatore, 4 unità usa e getta RCC |
| Unità RCC monouso | Synthecon | Contatta Synthecon | |
| 3 ml Luer-Lock siringa | BD | 309585 | |
| 10ml di ampio punta della pipetta sierologica | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| L-15 Leibovitz media, in polvere | Invitrogen | 41300-039 | |
| H 2 O, endotossine libero | Pescatore | MT-25-055-CM | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fruttosio | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galattosio | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030 | |
| Insulino-transferrina-Sodio Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140 |
Riferimenti
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.....
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Ristampe e permessi
