Forniamo una guida pratica per fornire traccianti In vivo E usare il percorso spinocerebellare come sistema modello per dimostrare passi essenziali per il successo dei circuiti neuronali nei topi. Descriviamo in dettaglio nostro protocollo versatile di analisi che sfrutta germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con fluorofori Alexa.
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Articolo metodologico
Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color
In questo articolo
Sommario
Abstract
Circuiti neurali sono organizzate in funzionali mappe topografiche. Al fine di visualizzare complessa architettura del circuito, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per etichettare il modello globale di molteplici proiezioni topografiche. Il cervelletto è un modello ideale per studiare la disposizione ordinata dei circuiti neurali. Per esempio, l'organizzazione compartimentale dei spinocerebellare fibre muschio ha dimostrato di essere un sistema indispensabile per lo studio di patterning muschio fibra. Abbiamo recentemente dimostrato che il germe di grano agglutinina (WGA), coniugata con Alexa 555 e 488 può essere utilizzato per il tracciamento spinocerebellare proiezioni in fibra di muschio nello sviluppo e topi adulti (Reeber et al. 2011). Abbiamo trovato tre proprietà principali che rendono il WGA-Alexa strumenti traccianti auspicabile per l'etichettatura di proiezioni neurali. In primo luogo, fluorofori Alexa sono intensi e la loro luminosità permette l'imaging wholemount subito dopo traccia. In secondo luogo, WGA-Alexa traccianti etichetta l'intera traiettoria di sviluppo e di adulti neurali projections. In terzo luogo, WGA-Alexa rivelatori rapidamente trasportato sia in direzione retrograda e anterograda. Qui, descriviamo in dettaglio come preparare i traccianti e altri strumenti necessari, come eseguire l'intervento chirurgico per spinocerebellare tracciamento e il modo migliore per proiezioni di immagini tracciate in tre dimensioni. In sintesi, forniamo un passo-passo il protocollo di analisi che sarà utile per decifrare l'organizzazione e la connettività di mappe funzionali non solo nel cervelletto, ma anche nella corteccia, tronco encefalico e del midollo spinale.
Protocollo
1. Fornire traccianti in vivo utilizzando chirurgia sterile (Sezioni 1,1-1,16)
Nel corso della procedura si consiglia di tecniche standard di sterili chirurgici essere utilizzato. Questo include l'utilizzo di guanti sterili, camice e mascherina. Strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso o puliti accuratamente con acqua e etanolo. Durante l'intervento, e soprattutto tra gli animali, frammenti di tessuto pulire gli strumenti e asciugare sterilizzare gli strumenti con un caldo tallone sterilizzatore (Steri 250 cat. # 18000-45, strumenti Scienza Fine). Inoltre, è fondamentale che a organizzare il vostro spazio di....
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Discussione
Abbiamo descritto i dettagli chirurgiche e tecniche necessarie per il successo tracciamento degli assoni e dendriti utilizzando un nuovo approccio basato fluorescente per rapidamente l'etichettatura proiezioni neurali nello sviluppo e topi adulti. Utilizzando WGA-Alexa si mostra come traccianti e marcatori possono essere usati per analizzare la topografia del circuito modellata ad alta risoluzione e in tre dimensioni.
Traccianti molti sono disponibili per il tracciamento circuiti neurona.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da investigatore nuove start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University di RVS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature / reagenti | Modello / Numero di catalogo | Azienda | |
| Tallone sterilizzatore | Modello Steri 250 cat. # 18000-45 | Strumenti Scienza multa | |
| Cauterizer | Gatto. # 18000-00 | Strumenti Scienza multa | |
| Vetro borosilicato capillari | Gatto. # 300056 | Harvard Apparatus | |
| Doppio stadio di vetro Micropipetta Puller | Modello 001-PC-10 | Narishige | |
| Micrometro siringa | Gatto. # GS-1100 | Gilmont Instruments | |
| Piccoli Animali Strumento Stereotassica | Modello 940-A | Kopf Strumentazione | |
| Elettrodo Manipolatore | Modello 960 | Kopf Strumentazione | |
| Vetcare camera | Gatto. #340508 | Harvard Apparatus | |
| Riscaldamento Pad | Gatto. # 341241 | Harvard Apparatus | |
| Leica DFC360 FX fotocamera | DFC360 FX | Leica | |
| Leica DFC490 fotocamera | DFC490 | Leica | |
| Leica DM5500 Microscopio | DM5500 | Leica | |
| Leica DFC3000 fotocamera FX | DFC3000 FX | Leica | |
| Leica MZ16 FA microscopio | MZ16 FA | Leica | |
| CY3 Filtro | Modello # 11600231 | Leica | |
| FITC Filtro | Modello # 11513880 | Leica | |
| A4 DAPI / filtro UV | Modello # 11504162 | Leica | |
| Germe di grano agglutinina, Alexa Fluor 488 coniugato | Gatto. # W11261 | Invitrogen | |
| Grano germ agglutinina, Alexa Fluor 555 coniugato | Gatto. # W32464 | Invitrogen |
Riferimenti
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).....
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Ristampe e permessi
