Protocolli per l'inoculazione vaginale e Prelievo dei campioni nel modello murino sperimentale di Candida Vaginite

Summary

Tecniche di chiave da utilizzare nella valutazione dei Candida in un modello animale sperimentale sono descritti. I metodi di permetterà una rapida raccolta di campioni vaginali e dei linfociti nei linfonodi di drenaggio lombare. Queste tecniche potrebbero dare origine a modelli murini di altre malattie del basso tratto genitale femminile.

Abstract

Candidosi vulvovaginale (VVC), causate da Candida specie, è una infezione fungina del basso tratto genitale femminile che colpisce circa il 75% delle donne in buona salute durante i loro anni riproduttivi ^18,32-34. I fattori predisponenti comprendono l'uso di antibiotici, il diabete non controllato e disturbi dei livelli degli ormoni riproduttivi dovuti alla gravidanza, contraccettivi orali o terapia ormonale sostitutiva ^33,34. VVC ricorrente (RVVC), definita come tre o più episodi l'anno, colpisce un separato da 5 a 8% delle donne senza fattori predisponenti ^33.

Un modello murino sperimentale di VVC è stato istituito e utilizzato per studiare la patogenesi e la risposta dell'ospite mucose da Candida ^{3,4,11,16,17,19,21,25,37.} Questo modello è stato utilizzato per testare potenziali terapie antifungine in vivo ^13,24. Il modello prevede che gli animali sono mantenuti in uno stato di optare per pseudoestrusIMAL Candida colonizzazione / infezione ^6,14,23. In tali condizioni, gli animali vaccinati avranno rilevabili vaginale carica fungina per settimane o mesi. Studi precedenti mostrano un parallelo estremamente elevata tra il modello animale e infezione umana rispetto alla proprietà immunologiche e fisiologiche ^3,16,21. Le differenze, tuttavia, sono la mancanza di Candida come normale flora vaginale e un pH neutro vaginale nei topi.

Qui, dimostrano una serie di metodi chiave del modello vaginite mouse che includono l'inoculazione vaginale, la raccolta rapida di campioni vaginali, la valutazione del peso vaginale da funghi, e preparati per l'estrazione dei tessuti cellulari / isolamento. Questo è seguito da risultati rappresentativi per i componenti del liquido di lavaggio vaginale, carica fungina e drenaggio linfatico rendimenti dei leucociti nodo. Con l'uso degli anestetici, i campioni di lavaggio possono essere prelevati in punti più tempo sui topi stessi per la valutazione longitudinaleinfezione / colonizzazione. Inoltre, questo modello non necessita di farmaci immunosoppressori per avviare l'infezione, permettendo studi immunologici in condizioni definite serie. Infine, il modello e ogni tecnica introdotta qui potrebbe potenzialmente dar luogo ad utilizzare le metodologie per esaminare altre malattie infettive del basso tratto genitale femminile (batteriche, parassitarie, virali) e le rispettive difese dell'ospite locale o sistemica.

Protocol

1. Inoculazione vaginale con Candida albicans

1. Tre giorni prima dell'inoculazione, mentre frenare l'animale per esporre l'addome, iniettare 100 ml di olio di sesamo contengono 0,1-0,5 mg di β-estradiolo per via sottocutanea nella parte inferiore dell'addome. Avanzare l'ago di circa 5 a 10 mm laterale alla pelle per ridurre la dispersione dal sito di iniezione.
   La somministrazione sottocutanea di estrogeni nel basso addome è ottimale in questo modello a causa della prossimità del tratto genitale. Dosi efficaci possono variare da ceppi di topi, di età o derivati ​​degli estrogeni. In studi precedenti con CBA-J (H-2 ^κ), C3H/He....

Discussion

Un modello murino sperimentale di vaginite da Candida è stata stabilita e storicamente usato per gli ultimi decenni a studiare la risposta mucosale ospite Candida, nonché per testare le terapie antimicotiche ^{3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37.} I protocolli presentati qui incorporare efficiente e metodi meno alta intensità di lavoro, e sembrano essere uno dei sistemi modello più ottimizzata di Candida vaginite descritto fino ad oggi. Queste tecniche consentono la quantificazione rapida .......

Materials

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Femmina CBA / J topi	Charles River Laboratories	01C38	5-6 settimane di età
Candida albicans (3153A)	Collezione nazionale di funghi patogeni, Regno Unito	NCPF3153
Olio di sesamo	Sigma-Aldrich	S3547	Non ha bisogno di essere pre-sterilizzati prima dell'uso
Β-17-estradiolo valerato	Sigma-Aldrich	E1631	0.1-0.5mg in olio di sesamo
Phytone peptone	Becton Dickinson	211906	Supplemento con 0,1% di glucosio
Blu tripano soluzione	Sigma-Aldrich	T8154
Sabouraud destrosio agar	Becton Dickinson	211584
Collagenasi di tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	0,25%
Dispasi	Invitrogen	17105-041	1,7 U / ml
Reti metalliche schermi	TWP	060X060S0065W36T	N. 60 mesh, inox
Sale Hanks 'soluzione equilibrata	Invitrogen	24020-117
CytoPrep fissativo	Fisher Scientific	12-570-10	Conserve diapositive striscio
Papanicolaou macchia EA-65	EMD chimici	7054X-85
Papanicolaou macchia OG-6	EMD chimici	7052X-85
Alum Harris 'ematossilina	EMD chimici	638A-85
Isoflurano	Baxter Healthcare	NDC 10019-773-60	Utilizzato con vaporizzatore isoflurano o in un sistema chiuso goccia anestetico da camera