Protocolli per l'inoculazione vaginale e Prelievo dei campioni nel modello murino sperimentale di Candida Vaginite

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare le specifiche problematiche procedurali associate all'utilizzo del modello animale sperimentale di candidosi vaginale come mezzo per quantificare il carico fungino vaginale, e anche di utilizzare cellule vaginali o linfoidi in saggi specifici come saggi immunologici e istologici. Ciò sarà ottenuto dimostrando prima la tecnica di inoculazione vaginale su topi trattati con estrogeni. Successivamente, dopo l'eutanasia del topo, verrà eseguita una lavanda vaginale per recuperare la candida.

Quindi verrà estratto il tessuto vaginale e/o i linfonodi drenanti vaginali. Il liquido di lavaggio può essere visualizzato al microscopio per mostrare la candida associata alle cellule epiteliali vaginali o placcato su agar per quantificare il carico fungino vaginale. Uno striscio della frazione cellulare può essere utilizzato anche per colorare le cellule epiteliali e le cellule linfoidi.

Quindi il vantaggio principale di dimostrare questa tecnica è che gli utenti del modello animale di vaginite possono farlo nel modo più efficiente ed efficace. E le domande chiave a cui viene data risposta attraverso la tecnica sono nel campo della vaginite e dell'ecologia e rispondono a domande chiave come le risposte immunitarie dell'ospite, la distribuzione cellulare, l'efficacia dei farmaci, l'efficacia immunoterapica e anche gli effetti dell'immunizzazione e la dimostrazione della tecnica. Oggi sarà uno studente laureato nel mio laboratorio, junco yano, per infettare un topo con C albicans tre giorni dopo aver somministrato un'iniezione di beta estradiolo.

Inizia stabilizzando il mouse su una superficie gRED piatta per farlo aderire. Quindi tieni la base della coda con due dita e solleva l'anca verso l'alto in modo che l'apertura vaginale sia rivolta verso di te. Inserire la punta della pipetta a circa cinque millimetri di profondità nel lume vaginale e pipettare fino a 20 microlitri di sospensione dell'inoculo.

Completa questo passaggio il più rapidamente e delicatamente possibile per ridurre al minimo l'angoscia nel mouse. Dopo il periodo di incubazione desiderato, sopprimere l'animale secondo il protocollo della propria struttura. Quindi, con due dita, tieni il mouse verso il basso per la base della coda in modo che l'apertura vaginale venga esposta con una pipetta.

Introdurre 100 microlitri di PBS sterile nel lume vaginale e, con ripetute aspirazioni e agitazioni, eseguire il lavaggio. Se il puntale della pipetta si ostruisce con le cellule, erogare le cellule ostruite e continuare a devastare con il PBS rimanente. Raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta per microcentrifuga.

Dopo la procedura di lavaggio vaginale, appoggiare il topo sulla schiena e saturare la zona inguinale con il 70% di etanolo. Usando un paio di pinze, sollevare l'orifizio urinario verso l'alto in modo che l'apertura vaginale sia esposta. Inserisci un paio di pinze curve nel lume vaginale e individua la cervice mantenendo una presa salda con la pinza.

Estrarre la cervice attraverso la cavità vaginale, asportare la vagina alla base dell'apertura vaginale, quindi rimuovere la cervice dalla vagina con le forbici chirurgiche. Poiché il tessuto vaginale è involuto, capovolgerlo per mantenere l'orientamento originale o aprirlo in un foglio praticando un'incisione laterale per l'escissione del nodo lombare con l'animale sulla schiena. Saturare l'addome con il 70% di etanolo.

Praticare un'incisione laterale partendo dal basso addome fino al torace ed esporre gli organi interni utilizzando un paio di pinze in entrambe le mani. Muovi l'intestino verso l'alto in modo che i vasi sanguigni centrali diventino visibili. Localizzare la vena cva inferiore e l'aorta addominale.

Una coppia di linfonodi lombari può essere identificata adiacente all'aorta addominale situata circa a metà strada tra l'origine delle arterie renali e iliache comuni. Questi linfonodi possono essere distinti visivamente dal tessuto adiposo per la loro consistenza elastica e sono più chiari e di colore più opaco rispetto al tessuto adiposo. Sono anche notevolmente più grandi negli animali infetti rispetto a quelli non inoculati.

Gli animali asportavano i linfonodi posizionando delle micro pinze sotto il nodo e poi li tiravano delicatamente verso l'alto per separarli dal tessuto circostante. Dopo l'asporta del tessuto, trasferire i linfonodi su uno schermo sterile a rete metallica posto all'interno di una capsula di Petri di vetro sterile contenente circa 10 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank. Per isolare le cellule linfoidi, fare riferimento al protocollo scritto.

Le frazioni cellulari del liquido di lavaggio vaginale di topi inoculati almeno quattro giorni prima sono tipicamente costituite da cellule epiteliali di candida e infiltrati cellulari, come mostrato qui dalla microscopia a montaggio umido. La candida può essere identificata dalla presenza di PHA e lievito. Qui vengono colorati i preparati di striscio di liquido per la lavanda vaginale.

Utilizzo della tecnica del pap test per esaminare le cellule epiteliali e i leucociti infiltranti di cui le cellule principali sono neutrofili, come può essere identificato dai lobi tracleari. Pochissimi neutrofili, se non nessuno, vengono rilevati nei topi non inoculati. Questa figura mostra un esempio di carico fungino vaginale.

Il liquido di lavanda vaginale viene raccolto in momenti specifici e coltivato per l'enumerazione delle UFC. In questo esempio, il fluido è stato raccolto al quinto giorno dopo l'inoculazione, in serie, diluito su piastra e incubato per 48 ore. Le colonie vengono quindi contate e il carico fungino vaginale calcolato La colonizzazione vaginale o l'infezione da candida persiste per settimane nei topi inoculati trattati con estrogeni.

Mentre la candida non riesce a stabilire la colonizzazione vaginale nei topi inoculati non trattati con estrogeni, i topi non inoculati trattati con estrogeni rimangono negativi per la candida per tutto il tempo. Inoltre, le lavande vaginali possono essere eseguite una volta su topi separati in ogni momento o longitudinalmente negli stessi topi sotto anestesia. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di trattenere gli animali in modo sicuro per evitare traumi alla vagina e prendersi il tempo necessario per lavare accuratamente per ottenere un carico fungino vaginale accurato durante l'estrazione dei tessuti vaginali.

Usa ancora PBS per evitare che si disidratino e fai attenzione a non danneggiare le vene e le arterie principali durante la rimozione dei linfonodi e durante l'elaborazione delle cellule linfonodali, tienile sul ghiaccio o a quattro gradi per mantenere la vitalità cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il modello murino sperimentale di vaginite da candida per quantificare in modo riproducibile il carico fungino vaginale e asportare tessuti vaginali o linfoidi per specifici test immunologici o istologici.