Protocolli per l'inoculazione vaginale e Prelievo dei campioni nel modello murino sperimentale di Candida Vaginite

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare aspetti specifici legati all'utilizzo del modello animale sperimentale di candidiasi vaginale per quantificare il carico fungino vaginale, nonché impiegare cellule vaginali o linfoidi in saggi specifici, come saggi immunologici e istologici. Questo obiettivo verrà raggiunto innanzitutto mostrando la tecnica di inoculazione vaginale su topi trattati con estrogeni. Successivamente, dopo l'eutanasia del topo, verrà eseguita una lavanda vaginale per recuperare il Candida.

Quindi il tessuto vaginale e/o i linfonodi drenanti vaginali verranno estratti. Il fluido di lavaggio può essere osservato al microscopio per mostrare la presenza di Candida associata alle cellule epiteliali vaginali oppure può essere seminato su agar per quantificare il carico fungino vaginale. Un’impronta della frazione cellulare può inoltre essere utilizzata per colorare le cellule epiteliali e le cellule linfoidi.

Il principale vantaggio della dimostrazione di questa tecnica consiste nel permettere agli utilizzatori del modello animale di vaginite di eseguirla nel modo più efficiente ed efficace possibile. Le domande chiave a cui si risponde mediante questa tecnica riguardano il campo della vaginite e dell'ecologia, e comprendono interrogativi fondamentali come le risposte immunitarie dell'ospite, la distribuzione cellulare, l'efficacia dei farmaci, l'efficacia dell'immunoterapia, nonché gli effetti della vaccinazione e la dimostrazione della tecnica stessa. Oggi, una studentessa laureata del mio laboratorio, Junco Yano, infetterà un topo con C. albicans tre giorni dopo aver somministrato un'iniezione di beta-estradiolo.

Posizionare innanzitutto il topo su una superficie gRED piatta in modo che possa aggrapparsi. Successivamente, afferrare la base della coda con due dita e sollevare il fianco verso l’alto in modo che l’apertura vaginale sia rivolta verso di voi. Inserire la punta della pipetta nel lume vaginale fino a una profondità di circa cinque millimetri ed erogare fino a 20 microlitri della sospensione inocula.

Completare questo passaggio il più rapidamente e delicatamente possibile per ridurre al minimo lo stress nel topo. Trascorso il periodo di incubazione desiderato, eutanasia l'animale seguendo il protocollo previsto per la struttura. Successivamente, con due dita, tenere il topo rivolto verso il basso per la base della coda in modo che l'apertura vaginale risulti esposta con una pipetta.

Introdurre 100 microlitri di PBS sterile nel lume vaginale e, mediante ripetute aspirazioni e agitazioni, effettuare il lavaggio. Se la punta della pipetta si ottura con le cellule, rilasciare le cellule ostruenti e continuare il lavaggio con il PBS rimanente. Raccogliere il fluido di lavaggio in una provetta per microcentrifuga.

Dopo la procedura di lavaggio vaginale, posizionare il topo in posizione supina e inumidire abbondantemente l'area inguinale con etanolo al 70%. Utilizzando una pinzetta, sollevare verso l'alto l'orifizio urinario in modo da esporre l'apertura vaginale. Inserire una pinzetta curva nella cavità vaginale e individuare la cervice mantenendo una presa salda con la pinzetta.

Estrarre la cervice attraverso la cavità vaginale, escindere la vagina alla base dell'apertura vaginale e quindi rimuovere la cervice dalla vagina con forbici chirurgiche. Poiché il tessuto vaginale è involuto, capovolgerlo per mantenere l'orientamento originale oppure aprirlo in una lamina praticando un'incisione laterale per l'escissione del linfonodo lombare con l'animale in posizione supina. Saturare l'addome con etanolo al 70%.

Eseguire un'incisione laterale partendo dall'addome inferiore fino al torace ed esporre gli organi interni utilizzando una pinza in ciascuna mano. Spostare l'intestino verso l'alto in modo da rendere visibili i vasi sanguigni centrali. Individuare la vena cava inferiore e l'aorta addominale.

Una coppia di linfonodi lombari può essere identificata adiacente all'aorta addominale, situata a circa metà strada tra l'origine delle arterie renali e quelle iliache comuni. Questi linfonodi possono essere distinti visivamente dal tessuto adiposo grazie alla loro consistenza elastica e sono di colore più chiaro e opaco rispetto al tessuto adiposo. Sono inoltre visibilmente più grandi negli animali infetti rispetto a quelli non inoculati.

Gli animali hanno escisso i linfonodi posizionando delle pinzette microchirurgiche al di sotto del linfonodo e sollevandolo delicatamente per staccarlo dal tessuto circostante. Dopo l'escissione del tessuto, trasferire i linfonodi su una griglia sterile in filo metallico posizionata all'interno di una piastra di Petri sterile in vetro contenente circa 10 millilitri di soluzione salina equilibrata di Hank. Per isolare le cellule linfoidi, consultare il protocollo scritto.

Le frazioni cellulari del liquido di lavaggio vaginale prelevato da topi inoculati almeno quattro giorni prima consistono tipicamente in cellule epiteliali di candida e infiltrati cellulari, come mostrato qui mediante microscopia in preparazione fresca. La Candida può essere identificata dalla presenza di ife e lieviti. Qui vengono colorate preparazioni di striscio del liquido di lavaggio vaginale.

Utilizzando la tecnica del pap test per esaminare le cellule epiteliali e i leucociti infiltranti, le cui cellule principali sono i neutrofili, riconoscibili per i lobi tracleari. Nei topi non inoculati si rilevano pochissimi neutrofili, se non addirittura assenti. Questa figura mostra un esempio del carico fungino vaginale.

Il liquido di lavaggio vaginale viene raccolto in specifici momenti temporali e coltivato per la conta delle UFC. In questo esempio, il liquido è stato raccolto al quinto giorno dopo l'inoculo, diluito in modo seriale, seminato e incubato per 48 ore. Successivamente vengono contate le colonie e calcolato il carico fungino vaginale; la colonizzazione o infezione vaginale da Candida persiste per settimane nei topi inoculati trattati con estrogeni.

Sebbene la candida non riesca a stabilire una colonizzazione vaginale nei topi inoculati non trattati con estrogeni, i topi non inoculati ma trattati con estrogeni rimangono negativi per la candida per tutta la durata dell'osservazione. Inoltre, i lavaggi vaginali possono essere eseguiti una sola volta su topi diversi in ciascun punto temporale oppure in modo longitudinale negli stessi topi sotto anestesia. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di immobilizzare saldamente gli animali per evitare traumi alla vagina e dedicare il tempo necessario per effettuare un lavaggio accurato al fine di ottenere un carico fungino vaginale preciso durante l'estrazione dei tessuti vaginali.

Utilizzare PBS stantio per evitare che si disidratino e prestare attenzione a non danneggiare vene e arterie principali durante la rimozione dei linfonodi e la lavorazione delle cellule linfonodali; mantenere i campioni sul ghiaccio o a quattro gradi per preservare la vitalità cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il modello sperimentale murino di vaginite da Candida per quantificare in modo riproducibile il carico fungino vaginale ed escindere tessuti vaginali o linfoidi per specifici saggi immunologici o istologici.