La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

Summary

Grazie alla semplicità di intervento e l'esito robusto comportamentale, costrizione cronica del nervo sciatico è uno dei preminenti modelli animali di dolore neuropatico. Entro 24 ore dopo l'intervento, ipersensibilità al dolore è stabilito e può essere misurato quantitativamente usando un von Frey aesthesiometer (test meccanici) e metro analgesia plantare (prova termica).

Abstract

Dolore neuropatico cronico, derivante da danni al sistema nervoso centrale o periferico, è una condizione diffusa e invalidante, che colpisce il 7-18% della popolazione di ^1,2. I sintomi includono spontanea (formicolio, bruciore, scosse elettriche-like) dolore, disestesia, parestesia, allodinia (dolore derivante dalla normalmente non dolorosi stimoli) e di iperalgesia (un aumento della risposta agli stimoli dolorosi). I sintomi sensoriali sono co-morbidità con disabilità comportamentali, come l'insonnia e la depressione. Per studiare il dolore neuropatico cronico diversi modelli animali che mimano lesione del nervo periferico sono stati sviluppati, uno dei più largamente usato è Bennett e Xie (1988) unilaterale nervo sciatico lesione cronica costrizione (CCI) ³ (Figura 1). Qui vi presentiamo un metodo per l'esecuzione di CCI e ipersensibilità al dolore test.

CCI viene eseguito in anestesia, con il nervo sciatico da un lato esposto da fare comeincisione parenti, e tagliando il tessuto connettivo tra le superficiale dei muscoli glutei e bicipiti femorale. Quattro legature gut cromico sono legati liberamente intorno al nervo sciatico a intervalli di 1 mm, per occludere solo, ma non arrestare il flusso di sangue epineurale. La ferita viene chiusa con suture nel muscolo e graffe nella pelle. L'animale viene poi lasciato riprendersi dalla chirurgia per 24 ore prima del test ipersensibilità dolore comincia.

Per la prova comportamentale, i ratti vengono inseriti nella apparecchiatura di prova e possono abituare la procedura di prova. L'area di prova è la metà della superficie plantare della zampa posteriore (figura 2), che rientra nel distribuzione del nervo sciatico. Soglia di ritiro meccanica viene valutata stimolando meccanicamente sia hindpaws feriti e uno illeso utilizzando elettronica dinamica plantare von Frey aesthesiometer o manuale von Frey capelli ^4. La soglia di ritiro meccanica è la pressione massima esercitata(In grammi) che fa scattare il ritiro zampa. Per la misurazione di latenza ritiro termico, descritto inizialmente da Hargreaves et al (1988), la zampa posteriore è esposto ad un fascio di calore radiante attraverso una superficie di vetro trasparente usando un misuratore plantare analgesia ^5,6. La latenza ritiro allo stimolo di calore viene registrato come il tempo per il ritiro zampa in entrambi i hindpaws feriti e illeso. Dopo CCI, soglia di ritiro meccanica, nonché latenza ritiro termico nella zampa feriti sono entrambi significativamente ridotto rispetto alla misurazioni e la zampa indenne (Figura 3). Il modello CCI di lesione dei nervi periferici in combinazione con il test del dolore ipersensibilità fornisce un sistema modello per studiare l'efficacia di potenziali agenti terapeutici per modificare il dolore cronico neuropatico. Nel nostro laboratorio, ci avvaliamo di CCI fianco sensibilità termica e meccanica delle hindpaws per indagare il ruolo delle interazioni neuro-immunitario nella patogenesie trattamento del dolore neuropatico.

Protocol

1. Costrizione nervo sciatico cronica

Tecniche asettiche deve essere utilizzato per la procedura chirurgica. Disinfettare la superficie chirurgica di lavoro con il 70% di etanolo e preparare in anticipo gli strumenti sterili (ad esempio, forbici, pinze sottili e riavvolgitore), garze, graffette e tamponi in autoclave. Per interventi chirurgici multipli, pulire e strumenti risterilizzare con il 70% di etanolo o uno sterilizzatore a secco perla tra ratti. Una maschera chirurgica, cofano capelli e guanti sterili devono essere indossati.

Per costrizione del nervo, preparare la sutura intestinale cromico tagliandolo in piccoli pezzi di circa 3 cm di lunghezza immersi in soluzione fisiologica sterile, per evitare l'essiccazione. Per chiudere la ferita, utilizzare punti di sutura in seta disponibili in commercio sterili.

1. Anestetizzare il topo in una camera di induzione con il 5% isoflurano in O _2, quindi consegnare il 2% isoflurano in O ₂ tramite una maschera su misura, e monitorare l'animale anestetizzato durante la procedura. Comuni anestetici alternativi vengono inalate alotano o intraperitoneale di sodio pentobarbital. Ketamina, come N-metil-D-aspartato (NMDA) antagonista del recettore, deve essere evitata poiché questi recettori sono importanti per lo sviluppo del dolore neuropatico.
2. Shave la gamba sinistra posteriore del ratto. Quindi, posizionare l'animale su un termoregolato stuoia riscaldamento a 37 ° C e applicare unguento oftalmico lubrificante per gli occhi.
3. Sterilizzare l'area rasata con tre applicazioni alternative del 70% di alcol isopropilico e una soluzione di iodio.
4. Con il ratto disteso sul suo petto / torace, elevare la zampa posteriore sinistra e tenerla in posizione con il femor a 90 ° rispetto alla colonna vertebrale con del nastro adesivo sul piede.
5. Praticare un'incisione in parallelo pelle, ma 3-4 mm al di sotto del femor, e liberare la pelle dal muscolo che circonda l'incisione tagliando attraverso il tessuto connettivo.
6. Usando le forbici, tagliare il tessuto connettivo tra i glutei e superficiale i bicipitifemorale muscoli.
7. Utilizzare un divaricatore per allargare il divario tra i due muscoli, consentendo la visualizzazione chiara del nervo sciatico.
8. Utilizzo di curve a punta smussa forcipe e micro-forbici, delicatamente libera di circa 10 mm del nervo sciatico (prossimale alla triforcazione sciatico) dal tessuto connettivo circostante.
9. Sotto il microscopio e una sorgente di luce buona, legare quattro legature (gut cromico 4.0, Ethicon, USA) con un doppio nodo, 1 mm l'una dall'altra, prossimale alla triforcazione del nervo sciatico. Per ogni legatura, inizia con un singolo ciclo sciolto, quindi afferrare le due estremità in prossimità del ciclo e stringere fino a quando il ciclo è appena avvolgente e la legatura non scivola lungo il nervo. Per mantenere l'anello in posizione corretta, collocare un secondo ciclo sopra il primo a completare il nodo. Infine, tagliare le estremità della legatura a circa 1 millimetro. La costrizione del nervo dovrebbe essere minimo, e immediatamente interrotta se un tic breve si osserva, per evitare l'arresto dei the flusso sanguigno epineurale. Nel corso stringendo le legature porta a assotomia e autotomia (automutilazione), sia effetti collaterali indesiderati che precludono il successo test ipersensibilità al dolore.
10. Utilizzare suture (Mersilk 5,0, Ethicon) per chiudere lo strato muscolare e graffette (Autoclip, 9 mm) per fissare la pelle. Successivamente, utilizzare la soluzione di iodio (Riodine) per sterilizzare la ferita.
11. Osservare il ratto da vicino durante il periodo di recupero anestesia, e permettono di recuperare in una gabbia separata con letto la carta in orizzontale (non lo standard letto zootecnia), al fine di evitare l'animale incosciente soffocamento.
    Prima di dare qualsiasi post-operatorie investigatori analgesia dovrebbe prendere in considerazione il fatto che questo può interferire con i test dolore ipersensibilità. Infatti, è evidente che l'applicazione locale di anestetico, lidocaina, al momento della lesione può alterare lo sviluppo di dolore neuropatico, e diminuire il grado di iperalgesia nelle settimane precedenti ^7. Per un'ulteriore discussione su questo mAttersee vedi recensione di Bennett et al ^8.

2. Misure di comportamenti Pain

1. Gestione quotidiana dei ratti per diversi giorni prima di iniziare l'esperimento si raccomanda, al fine di abituare i topi al loro gestore, ridurre lo stress e il rischio di mordere.
2. Prima di test comportamentali, i ratti devono essere abituati alla procedura di collaudo e la custodia degli animali. L'ambiente di test deve essere mantenuta tranquilla e ben controllata, con temperatura costante e livelli di umidità, e realizzato in un momento simile di giorno ogni sessione di test.
3. Ipersensibilità prova dolore dovrebbe essere eseguita diverse volte prima CCI (baseline) e in diversi momenti dopo la CCI, come desiderato.

3. Ritiro soglia meccanica

1. Il giorno di test, i topi posto nella gabbia elevata test maglia piani 15-30 minuti prima di misurare le soglie di prelievo, consentendo l'esplorazione e la gabbia raschiettogrammazione delle attività di cessare e ratti a diventare rilassato e fermo.
2. Utilizzando una dinamica plantare von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italia), la posizione del touch-stimolatore unità con il filamento direttamente sotto la metà della superficie plantare della zampa posteriore, evitando la rete metallica, e premere il tasto di avvio. Questo solleva il filamento di stimolare meccanicamente la superficie plantare della zampa posteriore con una forza crescente.

Manuali peli von Frey sono una serie di filamenti di diametro crescente che sono calibrati per indurre una forza specifica quando applicato alla pelle. Possono essere utilizzati come alternativa ad un sistema elettronico dinamica plantare aesthesiometer von Frey per la misurazione della soglia di ritiro zampa, come precedentemente descritto ^4. Ci sono anche diversi produttori di elettronica alternative di von Frey aesthesiometers (ad esempio IITC, Stati Uniti e Somedic, Svezia).

3. Registrare la soglia meccanica ritiro dal hindpa sia danneggiato e illesoWS, in un ordine controbilanciato. Questo dispositivo applica una pressione alla zampa e sulla reazione di astinenza il sistema registra e visualizza automaticamente la massima forza applicata (in grammi). Se una risposta ambigua verifica (ossia in caso di deambulazione o di grooming), ripetere lo stimolo e registrare nuovamente la soglia. Leccare o scuotimento della zampa posteriore a seguito di stimolazione è un segno di comportamento associato al dolore.
4. Ripetere la stimolazione meccanica 3 volte con un intervallo di circa 5 min tra gli stimoli, registrare le soglie, e quindi calcolare la media delle soglie di ritiro zampa.

4. Ritiro latenza termica

La (IR) l'intensità di calore a raggi infrarossi dello strumento di prova plantare deve essere regolata prima di iniziare l'esperimento. Nel nostro laboratorio, abbiamo regolare l'intensità IR per dare una latenza media di ritiro zampa di circa 10 secondi nei ratti naive, e abbiamo impostato il cut-off di latenza a 20 secondi per non danneggiare i tessutietà in caso di mancata rimuovere una zampa.

1. Il giorno di test, i topi posto nella gabbia di vetro, pavimenti in testing 15-30 minuti prima di misurare la latenza, permettendo l'esplorazione gabbia e governare le attività di cessare e nel ratto a diventare rilassato e fermo.
2. Utilizzando uno strumento di analgesia termica plantare (Ugo Basile, Italia), la posizione della sorgente di infrarosso direttamente sotto la metà della superficie plantare della zampa posteriore, e premere il tasto di avvio. Questo espone la superficie plantare della zampa posteriore per un fascio di calore radiante attraverso una superficie di vetro trasparente. Ci sono anche i produttori alternativi di strumenti termici analgesia plantare (ad esempio IITC, Stati Uniti e Stoelting, USA).
3. Registrare la latenza ritiro dal hindpaws sia feriti e illeso, in un ordine controbilanciato. Questo dispositivo registra automaticamente il tempo (in secondi) dall'inizio della dello stimolo termico al ritiro della zampa dalla fonte di calore. Se una risposta ambigua verifica (ossia in caso di ambulazione o governare), ripetere lo stimolo e registrare la latenza di nuovo. Leccare o scuotimento della zampa posteriore a seguito di stimolazione è un segno di comportamento associato al dolore.
4. Ripetere la stimolazione di calore almeno 3 volte con un intervallo di circa 5 min tra gli stimoli, registrare le latenze, e quindi calcolare la media delle latenze di ritiro zampa.

4. Risultati rappresentativi

Un esempio di soglia di ritiro di meccanica e la latenza di ritiro termale nelle zampe omolaterali (infortunato) e controlaterale (illeso) di ratti Wistar viene mostrata prima (baseline) e 2-12 giorni dopo la CCI nella Figura 3A, 3B e Figura. Da questi dati si può notare che CCI causa una riduzione significativa sia soglie di ritiro meccaniche e latenze ritiro termico della zampa posteriore omolaterale, indicando la presenza di ipersensibilità dolore meccanico e termico, entrambe le caratteristiche del dolore neuropatico cronico .

Figura 1. Uno schema che illustra il posizionamento delle legature nel modello CCI. Questo modello animale di dolore neuropatico prevede il posizionamento di quattro sciolti cromico-intestinale legature sul nervo sciatico, a metà coscia livello. Risulta in ferendo solo una parte degli afferenti vanno a l'ipersensibilità dolore al piede e successiva zampa posteriore.

Figura 2. Diagramma della superficie zampa posteriore utilizzato per il test del dolore. La metà superficie plantare appena posteriormente i piedini, come indicato dal cerchio rosso tratteggiata, viene utilizzato per il test del dolore. Questa zona è innervato principalmente dai rami terminali del nervo sciatico. Il tallone e cuscinetti plantari deve essere evitata a causa della sensibilità differenziale pelle.

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Figura 3. Ipersensibilità al dolore a seguito di costrizione cronica del nervo sciatico nel ratto. Dopo CCI, vi è una significativa riduzione della soglia zampa di ritiro agli stimoli meccanici (A) e il ritiro latenza zampa agli stimoli termici (B) nel lesa (omolaterali) zampa posteriore rispetto al indenne (controlaterale) zampa posteriore (p <0.01 misure ripetute 2 -way ANOVA). I dati mostrano media ± SEM, n = 7 ratti Wistar.

Discussion

CCI è un diffuso modello di lesione del nervo periferico del dolore cronico neuropatico. E 'relativamente semplice da eseguire, e produce ipersensibilità al dolore robusto e stabile per almeno un mese dopo l'infortunio. A seguito di CCI, i ratti mostrano postura anomala della zampa posteriore feriti (dita tenute insieme e plantare-flesso e della zampa rovesciato), così come agitando ripetutamente, guardia e di leccare il ferito zampa posteriore suggerendo la presenza di dolore spontaneo ^9. Oltre alla ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Gut cromico	Ethicon	G-211	Spessore 4-0
Isoflurano	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n / a
Mersilk	Ethicon	W-580	5-0 spessore
Autoclip	Becton Dickinson	427631	9 mm in acciaio inossidabile
Riodine	Orion	R1000802F	1% w / v iodio
Thermal strumento analgesia plantare	Ugo Basile	37370
Dinamica aesthesiometer plantare	Ugo Basile	37400