Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Sommario

Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

Abstract

Chinasi acetato, un membro della acetato e zucchero chinasi-Hsp70-actina (ASKHA) superfamiglia degli enzimi ^1-5, è responsabile della fosforilazione reversibile tra acetato e fosfato acetil utilizzando ATP come substrato. Chinasi acetato sono onnipresenti nei batteri, che si trova in un genere di Archaea, e sono presenti anche nei microbi del Eukarya ^6. Le chinasi acetato più ben caratterizzato è che dal metano che producono archaeon Methanosarcina thermophila ^7-14. Un acetato chinasi che può utilizzare solo _i PP ma non ATP in direzione della acetil-fosfato formano è stato isolato da Entamoeba histolytica, l'agente eziologico della dissenteria amebica, e finora state trovate solo in questo genere ^15,16.

In direzione della formazione di acetil-fosfato, acetato chinasi attività è in genere misurata mediante il test hydroxamate, in primo luogo descritto da Lipmann^17-20, un test accoppiato in cui è accoppiato conversione di ATP in ADP all'ossidazione del NADH a NAD ⁺ dal piruvato chinasi enzimi e lattico deidrogenasi ^21,22, o un saggio di misurazione rilascio di fosfato inorganico dopo la reazione del prodotto acetil fosfato con idrossilammina ^23. L'attività in senso opposto, acetato di formazione direzione si misura con accoppiamento formazione di ATP da ADP alla riduzione del NADP ⁺ a NADPH dagli enzimi esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi ^24.

Qui si descrive un metodo per l'individuazione di attività chinasi acetato nella direzione della formazione di acetato che non richiede enzimi di accoppiamento, ma è invece basato sulla determinazione diretta del consumo di acetil fosfato. Dopo la reazione enzimatica, rimanendo acetil-fosfato viene convertito in un complesso hydroxamate ferrico che può essere misurato spettrofotometricamente, come per il test hydroxamate. Così, a differenza del stANDARD test accoppiato per questa direzione che dipende dalla produzione di ATP da ADP, questo saggio diretto può essere utilizzato per chinasi acetato che producono ATP o PP _i.

Protocollo

Lo schema generale di questo protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione soluzione per le curve standard e saggi

1. Preparare 100 mL di una mol / L 2 soluzione di idrossilammina-HCl. Pesare 13,9 g di cloridrato di idrossilammina (MW 69,49 g / mol) e si dissolvono in circa 50 ml di acqua distillata, deionizzata (DDH ₂ O). Regolare il pH a 7,0 con pellet di idrossido di potassio o di una soluzione concentrata. Portare il volume finale a 100 ml. La soluzione può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 30 giorni a 4 ° C per un massimo di 90 giorni.
2. Preparare 100 ml di una soluzione di....

Discussione

Il rilevamento di fosfato di acetile in questo saggio dipende da una concentrazione sufficiente di cloridrato di idrossilammina e la concentrazione e l'acidità della soluzione di cloruro ferrico. Alterazione del volume test richiederà riconsiderazione di entrambi questi componenti. Le reazioni enzimatiche qui descritti sono stati eseguiti a 37 ° C con la cessazione idrossilammina eseguita a 60 ° C per 5 minuti. Questa temperatura più alta è fondamentale per consentire la rapida conversione del restante acetil fosfat.......

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetil fosfato	Sigma Aldrich	01409	Sale di litio (97%)
Sodio fosfato monobasico (disidratazione)	ThermoFisher	S381
Fosfato di sodio bibasico (anidro)	ThermoFisher	S374
Cloruro di magnesio (esaidrato)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Cloruro ferrico (esaidrato)	ThermoFisher	I88
Acido tricloroacetico	ThermoFisher	A324
Idrossilammina cloridrato	ThermoFisher	H330
Adenosina 5'-difosfato sale di sodio	Sigma Aldrich	A2754
BIOMATE III Spettrofotometro	ThermoFisher	142982082	Standard di UV / Vis spettrofotometro