Un rapido In vivo Test per verificare i composti neuromodulatori che utilizzano il sistema di Giant Fiber (GFS) di Drosophila melanogaster Descritto. Nanoinjections nella testa dell'animale insieme registrazioni elettrofisiologiche di GFS può rivelare la bioattività dei composti sui neuroni e muscoli.
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Articolo metodologico
Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant
In questo articolo
Sommario
Abstract
Composti di screening per l'attività in vivo può essere utilizzato come un primo passo per identificare candidati che possono essere sviluppati in 1,2 agenti farmacologici. Abbiamo sviluppato un nanoinjection / elettrofisiologia nuovo metodo di analisi che permette il rilevamento di effetti modulatori di composti bioattivi sulla funzione di un circuito neuronale che media la risposta di fuga in Drosophila melanogaster 3,4. Il saggio in vivo, che utilizza la fibra Drosophila Giant System (GFS, Figura 1) permette lo screening dei vari tipi di composti, come piccole molecole o peptidi, e richiede quantità minime per provocare un effetto. Inoltre, il GFS Drosophila offre una grande varietà di potenziali bersagli molecolari sui neuroni e muscoli. Le fibre giganti (GFS) sinapsi elettricamente (Gap Junction) e chimicamente (colinergica) su una sinapsi Interneuron Peripheral (PSI) e il Trochanteral Tergo Muscle neurone (TTMn) 5 6. Infine, la giunzioni neuromuscolari (NMJ) del TTMn e la DLMn con il salto (TTM) e dei muscoli di volo (DLM) sono glutamatergica 7-12. Qui, si dimostra come iniettare quantità nanolitri di un composto, ottenendo registrazioni elettrofisiologiche intracellulari dal sistema fibra Giant 13 e come controllare gli effetti del composto sulla funzione di questo circuito. Mostriamo la specificità del test con citrato methyllycaconitine (MLA), un antagonista nAChR, che interrompe il PSI di DLMn connessione, ma non il GF a TTMn connessione o la funzione del NMJ al salto o dei muscoli del volo.
Prima di iniziare questo video, è fondamentale che si guarda con attenzione e familiarizzare con il video intitolato "JOVE registrazioni elettrofisiologiche dal sentiero fibra gigante di D. Melanogaster "da Augustin et al 7, come il video presentato qui è inteso come un ampliamento di questa tecnica esistente. Qui si utilizza il metodo elettrofisiologico registrazioni e focalizzazione in dettaglio solo l'aggiunta delle nanoinjections accoppiati e la tecnica di monitoraggio.
Protocollo
1. Elettrofisiologia Rig Set-up
- L'attrezzatura necessaria per l'impianto elettrofisiologia set-up è descritto in dettaglio da Augustin et al. in questo Journal 14. Si prega di fare riferimento a questo articolo per una spiegazione dettagliata degli apparati elettrofisiologici necessari.
- Modificare il precedentemente descritto elettrofisiologia rig set-up 14 con l'aggiunta di un micromanipolatore sesto, che detiene il nanoinjector. Per accedere facilmente alla testa dell'animale deve essere collocato tra i due elettrodi micromanipolatori stimolanti come mostrato nella Figura 2. <....
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Discussione
Il nanoinjection / elettrofisiologia biotest qui presentata consente un rapido screening di composti nel sistema nervoso del moscerino della frutta. Si tratta di una nuova tecnica in vivo che richiede piccole quantità di un composto per provocare un effetto su una varietà di bersagli molecolari in un circuito ben caratterizzato neuronale. Questo metodo può essere utilizzato per testare la bioattività di diversi composti, da tossine sconosciuti agenti farmacologici disponibili in commercio.
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Mari e il laboratorio Godenschwege, in particolare Aline Yonezawa, per i commenti e aiutare con questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Nazionale per la Neurological Disorder and Stroke concessione R21NS06637 di FM e TAG, AB è stato finanziato dalla National Science il premio Foundation numero 082925, URM: Biologia Integrativa per i futuri ricercatori.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Registrazione elettrodi di vetro: vetro borosilicato capillari | Mondo Strumenti di precisione | 1B100F-4 | 1,0 millimetri OD, 0,58 millimetri ID |
| Stimolatore | Grass Instruments | Modello S48 | |
| Amplificatore | Come Instruments Inc. | Modello 5A | |
| Acquisizione dati Software: Digidata | Molecular Devices | Modello 1440A | |
| Software di raccolta dati: PClamp | Molecular Devices | Versione 10 | |
| Stereomicroscopio wesima fibra ottica microscopio illuminatore anulare | AmScope | SM-4T Modello HL 250-AR | |
| Dissezione possibilità per il montaggio | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite & Manual Micromanipolatore Tilting Base | Mondo Strumenti di precisione | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L | |
| Drosophila melanogaster selvatica 10E genotipo (ceppo selvatico) | Bloomington magazzino centrale | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Modello 700c | |
| Iniezione micropipette di vetro: vetro borosilicato capillari | Mondo Strumenti di precisione | Catalogo # 4878 | 1,14 millimetri OD, 0.5mm ID |
| Olio siliconico | Pescatore | Catalogo # S159-500 | |
| Beyeler | Sutter Instrument Co. | KT Brown Type Model # BV-10 | |
| Nanoliter2000 | Mondo Strumenti di precisione | Catalogo # B203XVY | |
| Colorante alimentare blu | McCormick | N / A | Ingredienti: acqua, glicole propilenico, FD & C Blue 1, e 0,1% Propylparaben (conservante). |
| Methyllycaconitine citrato (MLA) | Bioscience Tocris | Catalogo # 1029 | |
| Bastoncini di cera plastica | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
Riferimenti
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11
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