Summary
एकाधिक - लक्ष्य अनुरेखण एक घर में जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के भीतर अलग - अलग लेबल अणुओं पर नज़र रखने के लिए विकसित एल्गोरिथ्म है. कुशलता का पता लगाने, आकलन और उच्च घनत्व अनुरेखण पर समय के साथ अणुओं nanoscale झिल्ली गतिशीलता की जांच के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, व्यापक उपकरण प्रदान करने के लिए.
Protocol
इस वीडियो में, हम एक पूर्ण एकल कण ट्रैकिंग प्रयोग वर्तमान में, क्वांटम डॉट्स एक विशिष्ट झिल्ली रिसेप्टर के लिए लक्षित का उपयोग. इस प्रयोग मुख्य लक्ष्य भेदभाव आणविक प्रसार जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के भीतर मापा व्यवहार के विभिन्न प्रकार में शामिल है. दरअसल, आणविक झिल्ली में उत्पन्न होने वाले आंदोलनों आमतौर पर रैखिक निर्देशित किया जा रहा है या 26-29 उदाहरण के लिए nanodomains के, के भीतर तक ही सीमित द्वारा ब्राउनियन प्रसार से विचलित कर सकते हैं. हम एक साथ कई तकनीकी रूप से संभव के रूप में रिसेप्टर्स के रूप में निम्नलिखित पर करना है, एक जीवित कोशिका की झिल्ली के भीतर होने वाली गतिशीलता में उत्पन्न होने वाली विभिन्न प्रकार के एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं. यह अंततः सेल सतह रिसेप्टर संकेतन को विनियमित तंत्र का गूढ़ रहस्य की अनुमति की उम्मीद है.
1. सेल संस्कृति
- सेलुलर नमूना तैयार: उपयोग अनुयायी COS-7 कोशिकाओं जो endogenously epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) को 30 व्यक्त. जबजीवित कोशिकाओं के साथ काम कर के बिना एंटीबायोटिक दवाओं के लिए हर समय तैयार करने के दौरान उचित बाँझ तकनीक का उपयोग करके कोई अव्यक्त उप detectable संदूषण के लिए सुनिश्चित करें.
- पूरा मध्यम (10% बछड़ा सीरम के साथ DMEM, glutamine के 1%, 1% HEPES और 1% सोडियम पाइरूवेट, विशिष्ट अभिकर्मकों के नीचे तालिका देखें) में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, 37 ° C पर 7% सीओ 2 के साथ, देखभाल करने के लिए उन्हें में है उप मिला हुआ है, उन्हें लैब टेक में फैलने से पहले घातीय वृद्धि.
- प्रयोग के पहले दिन पर, +५००० कोशिकाओं / अच्छी तरह से और 8 अच्छी तरह से कक्षों (लैब - टेक) में फैल रातोंरात सेते हैं. कोशिकाओं गिनती एक निरंतर सेल घनत्व सुनिश्चित करता है, इसलिए सेल प्रति क्वांटम डॉट्स की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अनुपात.
2. सेल लेबल
एक विशेष कोटिंग के साथ क्वांटम डॉट्स की तैयारी. क्वांटम डॉट्स अर्धचालकों बना फ्लोरोसेंट नैनोकणों हैं. इन नैनोकणों एक उच्च ब्याज उपस्थित क्योंकि वे बहुत उज्ज्वल है और शास्त्रीय करने के लिए तुलना photostableफ्लोरोसेंट 31,32 जांच, जो एक अणु इमेजिंग के लिए शोर अनुपात (SNR) के एक उचित संकेत की उपलब्धि की अनुमति देता है.
- प्रयोग से पहले, हाइब्रिडोमा सेल लाइन (108 MAB, ATCC एचबी 9764) से EGFR के खिलाफ फैब टुकड़े, papain साथ पाचन द्वारा के रूप में पहले 21 में वर्णित है.
- बायोटिन साथ संयुग्म फैब, निर्माता के निर्देशों (ईज़ी - लिंक किट sulfo - एन एच एस-LC-biotinylation, थर्मो वैज्ञानिक, चित्र 1 ए) के अनुसार.
- क्वांटम डॉट्स 605 एनएम (प्रतिभा, पता लगाने और सेलुलर autofluorescence से अलग होने के लिए इष्टतम तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन) (Invitrogen) streptavidin और उत्सर्जन के साथ है functionalized का उपयोग करें.
- पूरा मध्यम में लेबलिंग समाधान तैयार (विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें), क्रम में करने के लिए क्वांटम डॉट्स के आसपास मौजूद streptavidins, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए एकत्रीकरण और गैर विशिष्ट कोशिकाओं को और coverslip के लिए बाध्यकारी को रोकने तर.
- दो मध्यवर्ती समाधान तैयार:एक क्वांटम डॉट्स streptavidin और biotinylated फैब के साथ एक और एक, 20 एनएम पर एक के साथ.
- इन दो समाधान की एक समान मात्रा के मिश्रण: 1:1 अनुपात में फैब क्वांटम डॉट्स के साथ मिश्रण करने के लिए 10 एनएम फैब की एक अंतिम काम एकाग्रता प्राप्त: जटिल क्वांटम डॉट्स. एक equimolar अनुपात का प्रयोग एक क्वांटम डॉट और एक biotinylated फैब टुकड़ा के मोनो functionalized बना परिसरों के गठन के पक्ष में है. यह monovalent लेबलिंग के पक्ष में, विरूपण साक्ष्य 33,34 पार से जोड़ने रिसेप्टर के कारण टिप्पणियों सीमित है.
- 25 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, प्रति मिनट 1200 घुमाव पर एक प्रकार के बरतन का उपयोग करने के लिए एकत्रीकरण को रोकने के. मिश्रण फिर जीवित कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार है.
- 5 मिनट के लिए मिश्रण के 100 μl में कोशिकाओं 7% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- गैर autofluorescent इमेजिंग (HbSS बफर,% 1 HEPES, विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें) मध्यम पूर्व 37 पर गरम डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं को धो
- ध्यान से लेबल से अधिक के लिए संयुक्त राष्ट्र को रोकने को हटानेआवश्यक SNR है अपार द्वारा खराब, ध्यान केंद्रित क्वांटम डॉट्स के बाहर बड़े पैमाने पर इमेजिंग मध्यम के साथ, आम तौर पर कमरे के तापमान पर 5 बार पिछले धोने से पहले कम से कम 5 मिनट देरी से प्रत्येक अच्छी तरह से धोने के द्वारा.
3. ऑप्टिकल सेटअप
सेटअप वीडियो माइक्रोस्कोपी चार प्रमुख भागों से बना है:
- एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति (FF01-457/50 उत्तेजना, FF495 Di02 dichroic, और FF01-617/73 उत्सर्जन फिल्टर, Semrock) घन और एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल (1.3 या 1.49) के विसर्जन 100x उद्देश्य के साथ एक उलटा माइक्रोस्कोप.
- एक 100 डब्ल्यू पारा दीपक (एक ऑप्टिक फाइबर के माध्यम से खुर्दबीन के लिए युग्मित, तापमान के साथ हस्तक्षेप से बचने).
- एक 512 x 512 पिक्सल के उच्च संवेदनशीलता कैमरा करने के लिए पर्याप्त SNR प्राप्त करने के EMCCD.
- एक 37 ° C पर प्रयोग के दौरान जैविक नमूने रखने इनक्यूबेटर.
4. अर्जन
- अलग और अच्छी तरह प्रसार कक्षों का चयन करें. यहअच्छा, फ्लैट lamellipodia के, सबसे अच्छा झिल्ली अणुओं की planar गति के लिए देखने के लिए अनुकूलित के विस्तार के पक्ष में है.
- दोनों पारेषित प्रकाश और प्रतिदीप्ति में अपनी उपस्थिति के द्वारा सेलुलर शारीरिक स्थिति का मूल्यांकन: तीव्र कोष्ठकी यातायात, परिगलित या apoptotic संकेत, कम autofluorescence, और औसत मजबूत लेबलिंग क्वांटम डॉट (आम तौर पर सेल प्रति 1,000 क्वांटम डॉट्स के अभाव को देखते हैं, अंजीर. 1 बी, सी).
- एक उच्च लेबलिंग घनत्व है, जो एक साथ संभव के रूप में के रूप में कई रिसेप्टर्स की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. यह वास्तव में शारीरिक (सतह अभिव्यक्ति का मिलान पहुँच, पार्श्व गति) और एल्गोरिथम मानकों (गैर अतिव्यापी बिंदु फैल (पीएसएफ) काम करता है, यहां तक कि खाते प्रस्ताव के कारण धुंधला में ले रही है, उचित का पता लगाने और कनेक्शन की अनुमति). दोनों के द्वारा सीमित है
- प्रत्येक कक्ष के लिए, पहले एक brightfield क्षेत्र के छवि (रियायत के तौर पर जिला उद्योग केंद्र का उपयोग कर, यदि उपलब्ध है) आगे सेल पहलू के लिए जाँच की अनुमति कर सकते हैं प्राप्तऔर lamellipodia के स्थानिक सीमा.
- इस वीडियो के ढेर (जैसे cell1.tif और उदाहरण के लिए cell1.stk) के रूप में एक ही नाम का उपयोग कर छवि को बचाने, डीआईसी नाम उप फ़ोल्डर में इन सम्मेलनों के बाद से,, एल्गोरिथ्म स्वतः मिलान के लिए छवि वापस पा सकते हैं प्रत्येक ढेर.
- सेल प्रति 1 से 3 वीडियो मोल, लगातार 36 एमएस दर, इस कैमरे के साथ पूर्ण फ्रेम में तेजी से प्राप्त दर पर आम तौर पर,. लेकिन एक उच्च आवृत्तियों पर प्राप्त कर सकते हैं 1-एमएस दर, वृद्धि की संवेदनशीलता और / या कम पिक्सल के साथ समर्पित सीसीडी का उपयोग. फ्रेम स्थानान्तरण प्रौद्योगिकी फ्रेम के बीच नगण्य देरी प्रदान करता है.
- इलेक्ट्रॉन गुणा वृद्धि हमेशा अधिकतम (बस संतृप्ति के नीचे, अगर प्रासंगिक) पर सेट किया जाना चाहिए तक पहुँचने के एकल अणु संवेदनशीलता, एक पर्याप्त SNR के साथ, कम से कम 20 डीबी (कुशल शिखर 1 का पता लगाने के लिए) ऊपर, आम तौर पर चारों ओर 25-30 डीबी की अनुमति है.
- आमतौर पर वीडियो, पाप, प्रति 300 फ्रेम अधिग्रहणCE के trajectories ~ औसतन 100 फ्रेम, ज्यादातर लंबी निमिष घटनाओं द्वारा सीमित में पुनर्निर्मित कर रहे हैं. वीडियो आवृत्ति और लंबाई दिया उपाय है, जो उदाहरण के लिए लंबे समय तक निशान की आवश्यकता होती है सकते हैं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
5. MTT विश्लेषण
- निर्देशिका वीडियो फाइल को समाहित करने के लिए Matlab या सप्टक साथ दिया डाटासेट का मूल्यांकन करने के लिए पथ चुनें.
- पूरी तरह से automatized 1,35 विश्लेषण शुरू करने के लिए, सप्टक, या MTT23i में Matlab में detect_reconnex23 आदेश टाइप करें. इस कार्यक्रम के लिए "संस्करण 2.3, उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ खड़ा है और डाउनलोड के लिए उपलब्ध है, पिछले संस्करण 2.2 के साथ साथ. यह पहली बार एक ग्राफिक इंटरफ़ेस सभी इस्तेमाल किया मापदंडों लिस्टिंग प्रदर्शित करता है, के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2.
6. प्रतिनिधि परिणाम
MTT स्वचालित रूप से प्रत्येक रिकॉर्डर वीडियो का विश्लेषण करती है, पता लगाया और लक्ष्य का अनुमान है, में आगे से पूरित के निशान देनेकारावास का पता लगाने के रूप में, vestigations. यह अंततः सेल छवियों (छवि 1C & 3) पर मानचित्रण निशान की अनुमति देता है.
MTT विवरण
कोर MTT विश्लेषण प्रत्येक फ्रेम पर किया जाता है, 3 मुख्य कार्य छवि (3) लागू:
- (क्वांटम डॉट) के एक स्लाइडिंग क्रमिक प्रत्येक पिक्सेल के आसपास केंद्रित उप - क्षेत्र है, जहां दो परिकल्पना की तुलना में कर रहे हैं के भीतर लक्ष्य की उपस्थिति या अनुपस्थिति की जांच: उपस्थिति या तो पीएसएफ साथ एक संकेत के रूप में एक द्वि - आयामी गाऊसी शिखर modelized , या केवल शोर, एक बीमा सीमा काफी कम झूठा अलार्म का उपयोग करते हुए कम से कम एक फ्रेम प्रति नकली पहचान के साथ. यह पता लगाने की संभावना की एक मानचित्र की ओर जाता है. प्रत्येक स्थानीय अधिकतम एक ख्यात लक्ष्य के रूप में माना जाता है, बीमा है कि इसकी संभावना स्तर न्यूनतम मूल्य है, झूठा अलार्म (पीएफए) के वांछित संभावना के अनुसार सेट की तुलना में अधिक है. यह काफी कम कुशलतापूर्वक हस्ताक्षर भेदभाव सीमा सेट कर दिया जाता हैशोर से nals, सबसे अच्छा नकली detections (पीएफए डिफ़ॉल्ट रूप से -6 10 के, 512 x 512 पिक्सेल छवियों में कम से कम एक त्रुटि बीमा) पर से परहेज है, जबकि अभी भी पता लगाने की एक पर्याप्त उच्च संभाव्यता की अनुमति, सैद्धांतिक भविष्यवाणी इष्टतम 1 तक पहुँचने. ध्यान दें कि एक उप - क्षेत्र का उपयोग करने की आवश्यकता का तात्पर्य है कि छवि सीमाओं (7 x 7 पिक्सल के एक डिफ़ॉल्ट खिड़की के लिए 3 पिक्सल,) का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है.
- उप पिक्सेल स्थिति और संकेत तीव्रता के रूप में प्रासंगिक मानकों के प्रत्येक लक्ष्य का पता चला है, के लिए अनुमान,. हर पता चला लक्ष्य के लिए, कम से कम वर्ग फिट गॉस - न्यूटन अगले करने के लिए स्थिति, और पता चला गाऊसी की चौड़ाई और ऊँचाई का अनुमान किया जाता है. यह विशेष रूप से रंग के उप पिक्सेल स्थिति (ठेठ SNR मूल्यों और स्थिर या धीरे से diffusing के रंगों के लिए 10 से 20 एनएम सटीकता, ~~ 100 एनएम के लिए 0.1 2 माइक्रोन / diffusing के रंगों के लिए बढ़ रही है) प्रदान करता है.
- के साथ नए लक्ष्य की reconnectionनिशान पिछले तख्ते पर पहले से ही बनाया गया है. नए लक्ष्य के सेट पिछले निशान के सेट के साथ मिलान किया जाता है. इस प्रयोजन के लिए, क्रम में एक का पता लगाने के लिए प्रत्येक लक्ष्य आवंटित करने के लिए, यदि संभव हो तो, सभी उपलब्ध सांख्यिकीय पता लगाने के कदम से प्राप्त जानकारी का उपयोग किया है, न ही स्थिति है, लेकिन निमिष भी तीव्रता, चौड़ाई, और संबद्ध आँकड़े. इसलिए, लक्ष्य निकटतम पता लगाने के लिए नहीं आवंटित कर रहे हैं: निशान पार, तीव्रता, गति, चौड़ाई और निमिष के मामले में विचार किया जाएगा. यह सांख्यिकीय इष्टतम कनेक्शन स्कोर बचाता है. इस रणनीति से बचा जाता है, जब संभव निकटतम पड़ोसियों की ओर कनेक्शन biasing पर.
चोटियों का पता लगाया गया खारिज कर दिया अगर उनके आकलन या कनेक्शन विफल रहता है अनुमान किया जा सकता है. एक विशेष परीक्षण नई चोटियों का पता लगाने, जो नए निशान को आरंभ होगा संभालती है. यह परीक्षण एक और अधिक कठोर पीएफए (-7 10) का उपयोग करता है, के बाद से एक का पता लगाने के लिए एक शिखर reconnecting की एक सत्यापन ओ के रूप में वस्तुत: व्याख्या कर सकते हैं च अपनी प्रासंगिकता (इस कसौटी परिभाषा के द्वारा नहीं, नई चोटियों के लिए लागू किया जा रहा है).
प्रक्षेपवक्र विश्लेषण
संभव क्षणिक कारावास अगले inversely स्थानीय 24-29 प्रसार से संबंधित समारोह के द्वारा मूल्यांकन किया है. एक सीमा लागू करने के लिए सीमित परिभाषित या नहीं एपिसोड के लिए अनुमति देता है. इन सभी निशान से अधिक पुनरावृति करने के द्वारा, हम झिल्ली गतिशीलता नक्शा / क्षणिक प्रसूति के मामले में नीचे की घटनाओं धीमी गति से कर सकते हैं. यह वैकल्पिक रूप से या तो द्विआधारी या इस कारावास सूचकांक के असतत मूल्यों का उपयोग करने का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
डिफ़ॉल्ट रूप से, MTT स्वचालित रूप से उन कार्यों को करता है, एक पाठ फ़ाइल में 8 शिखर मापदंडों बचत: फ्रेम संख्या, मैं और जम्मू की स्थिति, संकेत तीव्रता, त्रिज्या, ऑफसेट और प्रत्येक वीडियो फ्रेम (7 पंक्तियों के समूह) और (स्तंभ) का पता लगाने के लिए झपकी, . इन उत्पादन पैरामीटर Matlab या सप्टक आगे यानी निशान या संकेत तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए fread_data_spt स्क्रिप्ट का उपयोग करने में लोड किया जा सकता है, के रूप में उदाहरण. > "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt" परिशिष्ट में MTT_example स्क्रिप्ट.
इसके अलावा विश्लेषण प्रत्येक कक्ष पर निशान मैप (छवि 1C & 3) और प्रासंगिक मानकों (जैसे चोटी तीव्रता, SNR है या स्थानीय प्रसार मूल्यों के रूप में) के लिए हिस्टोग्राम वितरण प्रदान नेतृत्व. प्रत्येक फ़ाइल के लिए मतलब है, और प्रत्येक पैरामीटर के मानक विचलन एक पाठ फ़ाइल में सहेज कर रहे हैं, histograms की एक छवि के साथ साथ. वर्ग विस्थापन के लिए के रूप में 2 आर लघुगणक वितरण, ज्यामितीय मतलब करने के लिए नेतृत्व. प्रसार गुणांक डी एमएसडी वक्र के पांच पहले अंक से अधिक एक रेखीय फिट से computed है. इन मूल्यों को एक सेलुलर प्रतिक्रियाओं या दवा / एंजाइमी झिल्ली संगठन को प्रभावित उपचार के कैनेटीक्स उदाहरण के लिए शामिल प्रयोग के एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं. चूंकि MTT एक खुला स्रोत कोड है, इस पहलू आसानी से किसी भी समर्पित जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
"Alt =" 599fig1.jpg चित्रा 1 "/>
आकृति 1. निगरानी MTT से झिल्ली रिसेप्टर्स गतिशीलता (ए) EGFR जैसे झिल्ली घटकों,., क्वांटम डॉट्स biotinylated फैब टुकड़े (लगभग प्रत्येक अणु के सही स्केलिंग के साथ योजनाबद्ध ड्राइंग) करने के लिए युग्मित के साथ टैग कर रहे हैं. (ख) विशिष्ट फ्लोरोसेंट छवि रहते COS-7 सेल से प्राप्त कर लिया, 36 एमएस के जोखिम समय के साथ विवर्तन सीमित व्यक्तिगत लेबल रिसेप्टर के लिए इसी चोटियों चित्रण. (सी) MTT विश्लेषण का आउटपुट पुनर्गठन trajectories, रिसेप्टर्स की सेल की brightfield छवि पर मढ़ा.
चित्रा 2. MTT इनपुट पैरामीटर. MTT23i रनिंग एक ग्राफिक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस सभी इनपुट पैरामीटर, नाम, और डिफ़ॉल्ट मान के रूप में हमारे पिछले एक प्रकाशन में वर्णित लिस्टिंग को खोलता है. एल्गोरिथ्म, स्थान, और समय मानकों (खोज खिड़कियां, शिखर त्रिज्या, अधिकतम प्रसार में और निमिष), आयामरहित मानक इकाइयों, पिक्सेल, और फ्रेम में हैं. Calibrations उत्पादन परिणाम परिवर्तित अनुमान लागू किया जा सकता है. 156 एनएम / pxl और फ्रेम में देरी: 36 एमएस / फ्रेम डिफ़ॉल्ट मान 100x बढ़ाई के साथ एक झरना 512BFT करने के लिए इसी, पिक्सेल आकार के होते हैं.
जांचकर्ताओं अधिकतम उम्मीद प्रसार (फर्क अधिकतम) गुणांक और अधिकतम निमिष लापता होने ("टी बंद") के रूप में कुछ महत्वपूर्ण मापदंडों का अनुकूलन करना चाहिए. ये दोनों स्थान और समय सीमा के लगभग हैं ही हैं कि फिर से विचार किया जा एक दिया प्रयोगात्मक हालत के लिए, दूसरों को मजबूत डिफ़ॉल्ट मान सेट किया जा रहा है की जरूरत है. उदाहरण के लिए, झूठा अलार्म की संख्या सीधे मिलियन पिक्सल के प्रति कम से कम एक त्रुटि है, इसलिए कम से कम प्रति फ्रेम, जो ज्यादातर मामलों में संतोषजनक है सुनिश्चित करने के लिए सेट कर दिया जाता है. सभी मापदंडों उत्पादन फ़ोल्डर में एक पाठ फ़ाइल में सहेजा जाता है, अनुमति उपयोगकर्ताओं बाद में सत्यापित करने के लिए सेटिंग्स जो विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" चित्रा 3 "/>
चित्रा 3. MTT विश्लेषण की प्रमुख कदम प्रतिदीप्ति छवियों के एक प्रयोगात्मक ढेर से शुरू., चोटियों क्रमिक रूप से और स्वचालित रूप से पता चला रहे हैं एक गाऊसी फिट और तख्ते पर reconnected (आपरेशन के पहले रेंज, प्रवाह संचित्र के ऊपरी भाग) ने अनुमान लगाया है. निशान आगे के ख्यात प्रसूति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, अंततः प्रासंगिक डिस्क्रिप्टर (परिचालन की दूसरी श्रृंखला, निचले भाग) के एक गतिशील नक्शा करने के लिए अग्रणी.
चित्रा 4. लेबलिंग संयोजकता MTT प्रभावित नहीं करता है. संभव artefactual multivalent लेबलिंग द्वारा शुरू की पूर्वाग्रह मूल्यांकन MTT विश्लेषण के अंतर्जात 2 विभिन्न योजनाओं का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए और trajectories के नक्शे का विश्लेषण टैग EGFR ट्रैक किया गया था. (ए) रिसेप्टर्स biotinylated फैब और क्वांटम dots605 का का - streptavidin के साथ टैग किए गए थे, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है.इस मामले में, क्वांटम डॉट्स और streptavidins बहु संयोजकता एक एकल डाई करने के लिए कई रिसेप्टर्स युग्मन में परिणाम हो सकता है. (बी) रिसेप्टर्स फैब सीधे एक जैविक डाई, Atto647N की युग्मित के साथ टैग किए गए थे. इस मामले में, एक फैब, इसलिए एक रिसेप्टर, एक से अधिक डाई करने के लिए युग्मित किया जा सकता है. (सी) मीन वर्ग विस्थापन वक्र (एमएसडी) के प्रत्येक कक्ष के लिए सभी निशान के लिए अभिकलन, क्वांटम डॉट या Atto रंजक (बाएँ और दाएँ रेखांकन, क्रमशः) के साथ या तो लेबल. प्रसार गुणांक एमएसडी (लाल बिंदीदार रेखा) के पांच पहले अंक से अधिक रैखिक फिट द्वारा गणना की गई. प्रत्येक योजना के समान प्रसार मूल्यों (केंद्रीय ग्राफ) के नेतृत्व में लेबलिंग की. Qdot: क्वांटम dots605 (n = 5 कोशिकाओं), Atto Atto647N: (एन = 7 कोशिकाओं), एनएस: (Student टी परीक्षण पी मूल्य> 0.05) महत्वपूर्ण नहीं है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एकल कण ट्रैकिंग में, सेल और माइक्रोस्कोपी पहलुओं के बगल में, विश्लेषण काम का एक बड़ा हिस्सा प्रतिनिधित्व करता है. यह तीन मुख्य कार्य करने के लिए उपयोग किया एल्गोरिथ्म पते का पता लगाने, आकलन और प्रत्येक फ्रेम पर reconnecting की चोटियों. लेकिन इस काम के फलस्वरूप पहलू एल्गोरिथ्म ही है, जो किसी भी नए समर्पित, पिछले है, अतिरिक्त कदम (जैसे गति के मोड, बातचीत या stoichiometry गूढ़ रहस्य के रूप में) के लिए अनिवार्य रूप से जांच के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है विस्तार में रहता है.
हालांकि, एक बार एल्गोरिथ्म पूरी तरह से विकसित चल रहा है यह सरल है, खासकर के बाद से हम न्यूनतम छवि (3) पर इनपुट पैरामीटर की संख्या रखने पर ध्यान दिया. यह बहुत मजबूत MTT और लागू करने के लिए आसान renders. जब MTT विस्तार, हम पूरी तरह से विश्लेषणात्मक प्रत्येक कार्य के लिए इस्तेमाल किया विकल्पों पर पुनर्विचार करने के उद्देश्य से. हम दो चुनौतीपूर्ण axes साथ प्रक्रिया का अनुकूलन करना चाहता था:
- बुद्धि कामलेबलिंग की ज उच्च घनत्व सेल सतह के नमूने की अवधि में विस्तृत स्थानिक जानकारी प्रदान करता है. आदर्श रूप में, एक लगभग पूरी आणविक जनसंख्या एक साथ पालन करें, क्रम में करने के लिए एक व्यापक अवलोकन प्राप्त करने की कोशिश करेंगे. हालांकि, इस तरह के व्यापक लेबलिंग एक कि प्रतिष्ठित immunofluorescence से प्राप्त करने के लिए इसी तरह की छवि के लिए सीसा, एकल अणु संकल्प के बिना होता है, के बाद से सभी लेबल विवर्तन के लिए दृढ़ता से कारण ओवरलैप. ठेठ आणविक संख्या के लिए (यानी ~ 10 30 सेल द्वारा 5 रिसेप्टर्स) और सेल आकार (यानी ~ 30 माइक्रोन), अगर हम सजातीय वितरण मान, औसत दूरी अंतर अणु ~ 100 एनएम है. आम तौर पर ~ 0.1 2 माइक्रोन / s पर ब्राउनियन गति के लिए 100 एनएम एमएस दौरान 30: अधिग्रहण के दौरान प्रसार भी एक तुलनीय हद तक पीएसएफ के प्रसार के लिए योगदान देता है. उल्लेखनीय है, इस के प्रसार के औसत पर isotropic है और इस प्रकार अभी भी एक गाऊसी तरह पीएसएफ उत्पन्न. इसलिए सैद्धांतिक रूप से जनसंख्या का 10% तक जा पाया जा सकता है के बाद से इस घास का मैदान~ 300 एनएम, विवर्तन गति और सीमा के साथ संगत के एक औसत दूरी के लिए घ. हालांकि, इस स्थानिक वितरण में inhomogeneity के लिए लेखांकन द्वारा modulated किया जा करने की जरूरत है, सीमाओं लेबल (जैसे steric की कमी, का मिलान पहुँच, आदि के रूप में) बढ़ रही है और भी न सुलझा हुआ trajectories के पार, और समग्र दक्षता का पता लगाने के कारण संघर्ष. प्रयोगात्मक, हम तक पहुँचने के लिए और सही पर नजर रखने के कुल जनसंख्या का एक बड़ा हिस्सा सकता है ~ 80 माइक्रोन चौड़ाई के दृश्य का एक क्षेत्र के भीतर 1000 लेबल के घनत्व के साथ. व्यक्तिगत detections के लिए की जरूरत है और एक संपूर्ण स्थानिक माप (छवि देखते हैं 1C स्थानिक कोशिका की सतह के नमूने की सराहना करते हैं.) के लक्ष्य के बीच एक समझौता से यह ऊपरी सीमा का परिणाम है.
- हैंडलिंग कमजोर संभव SNR है या तो कम रोशनी है, जो कोशिकाओं व्यवहार्यता, और / या उच्च गति है, जो बेहतर अस्थायी जानकारी प्रदान करता है के लिए फायदेमंद है इमेजिंग की अनुमति देता है. हालांकि, यह कम संकेत निकलता हैप्रति छवि, एकत्र फोटॉनों की कम संख्या के कारण. ध्यान दें कि EMCCD कैमरों (1 एमएस) द्वारा कम से कम समय प्राप्त करने के लिए उचित और MTT से पता लगाने के आकलन के लिए न्यूनतम स्वीकार्य SNR (20 DB) के अनुरूप होता है.
संयोजकता लेबल एकल अणु पढ़ाई में एक आवर्ती समस्या है. वास्तव में, / डाई लक्ष्य के अनुपात सीधा उपाय अत्यधिक 34 चुनौतीपूर्ण है. हालांकि, ख्यात artefactual multivalent लेबलिंग द्वारा शुरू की पूर्वाग्रह की जांच के लिए एक वैकल्पिक तरीका है या तो क्वांटम डॉट (डाई प्रति कथित रूप से कई लक्ष्यों के साथ, crosslinking उत्प्रेरण artefactual) टैग या कार्बनिक डाई टैग के साथ (, पर इसके विपरीत, कथित रूप से कई रंगों के साथ उपायों की तुलना में होते हैं लक्ष्य के प्रति, केवल संकेत तीव्रता biasing पर और विशेषताओं विरंजन). हम और 6,36,37 अन्य तुलनीय व्यवहार देखा है जब या तो क्वांटम डॉट्स या कार्बनिक रंजक (हमारे मामले में atto647N, चित्र 4.) का उपयोग कर प्रसार और मो के बीच संक्रमण के मामले में,देस की गति. दो स्थितियों के बीच प्रसार के मूल्यों में रूपांतर सेल करने वाली कोशिका असमानता (छवि 4C) से कम है. इससे पता चलता है कि लेबलिंग संयोजकता भी monovalent सख्ती से नहीं, काफी SPT परिणाम को प्रभावित नहीं करता है.
प्रसूति और आण्विक सहभागिता
क्षणिक या स्थिर कारावास तरजीही संबंध या 24-29 बातचीत के हस्ताक्षर के रूप में व्याख्या की जा सकती है. Biomembranes वास्तव में स्थानीय hydrophobicity, transmembrane आकार और interfacial तनाव जैसे संरचनात्मक सुविधाओं से तय विधानसभाओं के साथ जोरदार inhomogeneous. इन ड्राइविंग बलों यानी संकेत, आसंजन या तस्करी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका के साथ कार्यात्मक विधानसभाओं के spatiotemporal remodeling के लिए सीसा. मानचित्रण और इस तरह की घटनाओं को बढ़ाता समझने कैसे एक सेल में लगातार प्रस्तुत उत्तेजनाओं को एकीकृत करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रदान करने के लिए उम्मीद है. वास्तव में, किसी कक्ष के लिए, एक सटीक प्रतिक्रिया अनुरोध के माध्यम से पर्याप्त अनुकूलन प्रदर्शनuires संकेत भागीदारों और अपने वातावरण के बीच बातचीत ट्यूनिंग. झिल्ली रिसेप्टर्स या तो उप झिल्ली cytoskeleton बाड़, endocytic गड्ढ़े या फोकल adhesions के रूप में झिल्ली संरचनाओं, या भी proteic / लिपिड भागीदारों, उदाहरण के लिए डोमेन संकेत में शामिल के साथ बातचीत कर सकते हैं. हमारे प्रतिनिधित्व में, इस तरह की घटनाओं के को कारावास शक्ति और स्थान और समय के साथ अपनी विविधताओं के माध्यम से जांच की जा सकता है. इस आगे सर्वोच्च प्राप्त अंतरिक्ष समय संकल्प पर काम कर, कम समय और उच्च घनत्व से जुड़े बाधाओं को ध्यान में रखते हुए, जैसा कि ऊपर चर्चा के महत्व को मजबूत.
पूरक तकनीक
यह एक अच्छा अभ्यास के लिए अन्य तरीकों के साथ इस तरह गतिशील माप की तुलना है. उदाहरण अन्य गतिशील माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए, FRAP और एफसीएस की तरह, पूरक संवेदनशीलता और 4,38,39 संकल्प प्रदान करते हैं. FRAP आणविक प्रसार का एक कलाकारों की टुकड़ी माप प्रदान करता है, जबकि एफसीएस है पहुँच सकते हैंएक बहुत अच्छा समय संकल्प के साथ संवेदनशीलता चिमनी अणु,. हालांकि, दोनों तरीकों को स्वाभाविक रूप से एक स्थानीय उपाय (आमतौर पर एक confocal स्थान के भीतर) के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं. यह हमें लाभ लेने के लिए और SPT के स्थानिक संभावनाओं की सीमा बढ़ाने के लिए प्रेरित देखने के एक बड़े क्षेत्र की जांच, एक बार में एक पूरे सेल शामिल है, एक स्थानीय रूप से प्रासंगिक spatiotemporal सटीकता के साथ साथ.
इसके अलावा विकास और जांच
जैविक सवाल है कि एकल अणु माप का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है की सीमा के अनुसार, MTT विभिन्न दिशाओं के साथ बढ़ाया जा सकता है, प्रत्येक स्तर पर पता लगाने, अनुमान कनेक्शन है, और आगे विश्लेषण. उदाहरण के लिए, एक एक से अधिक आणविक जनसंख्या के साथ निपटने पर विचार करें, बहुरंगा पता लगाने के लिए बुला सकते हैं - के रूप में समर्पित ऑप्टिक या विश्लेषणात्मक योजनाओं का उपयोग किया जा सकता है. आकलन किसी भी वर्णक्रमीय या ध्रुवीकरण जानकारी के रूप में नई प्रासंगिक डिस्क्रिप्टर, या अक्षीय शामिल कर सकते हैं40 3 डी में अनुरेखण के लिए बढ़ा z स्थिति,.
कनेक्शन के लिए, ब्राउनियन और निमिष मान्यताओं को पूरी तरह से एक विशिष्ट समस्या के लिए फिर से विचार किया जा सकता है. काफी दिलचस्प है, एकल अणु माप तथाकथित नैनोस्कोपिक 17,22,23 शासन करने के लिए किया गया है पिछले एक दशक से अधिक बढ़ाया है. हालांकि MTT सीधे एकल अणु स्थानीयकरण को संबोधित है, यह महत्वपूर्ण महत्व का है एक निश्चित नमूना है, जो एक आणविक जनसंख्या के एक संपूर्ण स्थानीयकरण के लिए एक सुरक्षित समाधान प्रदान करता है के मामले पर विचार करें. हालांकि, इस तरह के एक मामले में, ब्राउनियन धारणा नहीं रह गया है मान्य है. यह सही एक नैनोस्कोपिक उपाय है, SNR द्वारा ही सीमित है, से निपटने जगह सर्वोत्तम nanometric संकल्प तक पहुँचने के लिए महत्वपूर्ण है.
ऐसी घटनाओं, या तो 3 डी बहुरंगा, और / या संपूर्ण उपायों के आधार पर के साथ, भविष्य के काम करने के लिए आणविक स्थिर और गतिशील डेटा का व्यापक दृश्य देने की उम्मीद है. यह एक प्रत्यक्ष relev होगासेल सूक्ष्म अतिरिक्त और intracellular संकेतन विनियमन रूपरेखा गूढ़ रहस्य के रूप में जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए मंजूरी.
MTT डाउनलोड
MTT के स्रोत कोड शैक्षिक अनुसंधान के लिए खुले स्रोत सॉफ्टवेयर के रूप में उपलब्ध है. यह हमारे वेब पेज से डाउनलोड किया जा सकता है, हमारी टीम पृष्ठ के लिए नेविगेट करने में ciml.univ mrs.fr , वह और Marguet लैब, जो सॉफ्टवेयर के विवरण और डाउनलोड के लिए एक लिंक प्रदान करता है. कृपया ध्यान दें कि हम और जानकारी के लिए केवल अपने नाम की संस्था के लिए आप पूछते हैं, या आगे सहयोग के मामले में उदाहरण के लिए आप एक नया रिलीज या अद्यतन के बारे में सूचित.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम हमारी टीम के सदस्यों, तकनीकी सहायता के लिए विशेष रूप से एम सी Blache, के रूप में अच्छी तरह से एम Irla और बी Imhof के उनके समर्थन और उपयोगी विचार विमर्श के लिए, धन्यवाद. अपस्फीति और प्रसूति के लिए आंकड़े प्रकृति के तरीके के सौजन्य से reproduced. इस परियोजना से CNRS, INSERM और मार्सिले विश्वविद्यालय के, और Provence-Alpes-Côte-d'Azur क्षेत्र, राष्ट्रीय Institut du कैंसर, Agence Nationale डे ला Recherche (से विशिष्ट अनुदान द्वारा संस्थागत अनुदान द्वारा समर्थित है ANR-08-PCVI 0034-02, ANR २,०१० 1214 BLAN 01) और Fondation डालना ला Recherche MEDICALE (Equipe labélisée एफ आर एम 2009). VR लीग Nationale Contre ले कैंसर से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
