Summary
Visualisering af koronarkar er afgørende for at fremme vores forståelse af hjerte-kar-sygdomme. Her beskriver vi en metode til perfusion murine koronar kar med en røntgenfast silikonegummi (Microfil), som forberedelse til mikro-Computed Tomography (μCT) billeddannelse.
Abstract
Visualisering af vaskulaturen bliver stadig vigtigere for forståelsen af mange forskellige sygdomstilstande. Mens flere teknikker eksisterer for billedbehandling kar, få er i stand til at visualisere det vaskulære netværk som en helhed og samtidig udvide til en resolution, der omfatter mindre skibe 1,2. Desuden er mange vaskulære støbeteknikker ødelægge det omgivende væv, hvilket forhindrer yderligere analyse af prøven 3-5. En metode, der omgås disse spørgsmål, er mikro-Computed Tomography (μCT). μCT billeddannelse kan scanne i opløsninger <10 um, er i stand til at producere 3D rekonstruktion af det vaskulære netværk, og efterlader vævet intakt til efterfølgende analyse (f.eks histologi og morfometri) 6-11. Men, billedbehandling fartøjer ved ex vivo μCT metoder kræver, at fartøjer fyldt med en røntgenfast stof. Som sådan er den nøjagtige gengivelse af vaskulaturen fremstilles ved μCT billeddannelse betingetpålidelige og fuldstændige fyldning af skibene. I denne protokol, beskriver vi en teknik til at fylde mus koronarkar i forberedelse til μCT billeddannelse.
To dominerer teknikker eksisterer til fyldning af koronar vaskulaturen: in vivo via en kanyle og retrograd perfusion af aorta (eller en gren af aortabuen) 12-14 eller ex vivo via en Langendorff perfusionssystem 15-17. Her beskriver vi en in vivo aorta kanylering metode, der er specielt designet til at sikre fyldning af alle fartøjer. Vi anvender en lav viskositet røntgenabsorberende stof kaldet Microfil som kan perfundere gennem mindste fartøjer for at fylde hele kapillærer, såvel som både arterielle og venøse side af det vaskulære netværk. Skibe perfunderet med buffer med en tryksat perfusionssystem, og derefter fyldt med Microfil. At sikre, at Microfil fylder mindre højere modstand fartøjer vi ligere de store grene emanating fra aorta, som afleder Microfil ind i blodpropper. Når påfyldning er fuldført, for at forhindre den elastiske beskaffenhed af hjertevæv fra presse Microfil af nogle kar, vi ligere tilgængelige store vaskulære udgangssteder umiddelbart efter fyldning. Derfor er vores teknik optimeret til fuldstændig fyldning og maksimal retention af fyldstof, muliggør visualisering af hele koronar vaskulære netværk - arterier, kapillærer og vener ens.
Protocol
1. Forberedelser før start
- Fylde hver side af trykket perfusion apparatet med vasodilator puffer (4mg / l Papaverin + 1 g / L Adenosin i PBS) eller 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, hhv.
- Forbered en 1/2cc insulinsprøjte (med fastmonteret 29g ½ "nål) ved at fylde den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000U/ml lager) og bøje nålen til ~ 120 graders vinkel med facet op. Gør samme med en 1 ml sprøjte (med en 26G ½ "nål) fyldt med 0,3 ml mættet KCI-opløsning.
2. Udsætte hjertet og cannulating aorta
- Bedøver musen ved hjælp af din bedøvelse valg. (Vi anvender en overdosis af en Ketamin / Xylazin blanding. IP injektion af 130 mg / kg ketamin og 8,8 mg / kg xylazin i saltopløsning)
- Nål bedøvet musen på dissekere bakken, ventral opad. Åbne bughulen med en midtlinieincision, og trække hudenat udsætte de organer. Bevæge tarmene til den ene side for at blotlægge et område af den posteriore Vena Cava (PVC).
- Injicer Heparin opløsningen i PVC. Som du trække nålen, dække kanylen hullet med en bomuld spids applikator for at forhindre lækage og holde det i et par sekunder, indtil de PVC-væg blodpropper og sæler. Vent 2-3 minutter for heparin for at dispergere hele muse cirkulation.
- Dissekere mellemgulvet og brystkassen, så du kan observere bankende hjerte. Injicer langsomt KCl-opløsning i PVC, indtil hjertet anholdelser.
- Fjerne alle organer under membranen og udskære bageste del af mus, der forlader området forreste af membranen intakt. Fjern mellemgulvet, være omhyggelig med at skære PVC i nærheden af mellemgulvet, så den del nærmest hjertet er nemt at finde i de efterfølgende trin.
- Lokalisere den afskårne ende af aorta. Placere en lang længde af 6-0 flettet silkesutur under aorta nogle få millimeter anteriore tilbagem den afskårne ende, således at suturen fordobles tilbage på sig selv. Skær denne længere sutur på midten, så der er 2 stykker af sutur under aorta. Indsætte angiokateter i den afskårne ende af aorta (figur 1A, B) og binde hver sutur med et dobbelt-knude for at holde angiokateter på plads og forhindre enhver modtryk i aorta i at lække ud.
3. Perfusion og Microfil injektion
- Forbinde angiokateter til trykket perfusion apparat (fig. 2) og begynde perfusion af fartøjer med vasodilator-buffer (figur 1C) ved at pumpe perfusion apparatet til en drivende tryk på 100-110 mm Hg. Dobbelttjekke, at buffer perfusion gennem blodpropper ved at sikre væske er spændende fra PVC. Fortsat perfundere i mindst 3 minutter, eller indtil væsken forlader PVC er klar. (Fortsæt med de næste skridt, mens perfusion.)
- Dissekere ribbenene og ben tilbage (eller fjern) brystkassen at eksponere hjertet. Når først udsættes for, være careful ikke at lade kernen tørre ud ved at klemme dråber puffer på hjertet fra en buffer-gennemblødt stykke gaze. Rydde thymus for at blotlægge aortabuen. Ligere de tre større aorta grene med 6-0 flettet silkesutur for at sikre væske ledes gennem blodpropper snarere end gennem disse større, lav modstand fartøjer (figur 1D).
- Perfundere hjertet med fiksativ i 15 minutter, derefter skylles med Vasodilatation buffer i mindst 2 minutter. I mellemtiden ligere både anteriore hulvene at forhindre Microfil i at lække ud af hjertet efter injektion (figur 1E). Placer suturer omkring PVC og aorta, men ikke stramme dem, indtil efter påfyldning.
- Forbered Microfil (som angivet i tabel af reagenser), og indlæse den i en 1 ml sprøjte. Fyld dissektionsbakke med tilstrækkeligt vand til at dække kateteret (for således at forhindre indføring af luftbobler, når der skiftes fra perfusionsslange til Microfil sprøjte). Afbryd perfusion APparatus fra kateteret og forbinder den præparerede Microfil sprøjten.
- Injicere Microfil i aorta, indtil en god fyldning af koronararterier er tydelig (figur 1F, 3A): arterierne vil fylde først, og derefter Microfil vil "spildes" i kapillarer som væv flugter med farven af Microfil. Når på den venøse side, får den hydrofobe karakter af Microfil det i første omgang vises som selvstændige sfærer, som det fremgår af de mindre fartøjer. Fortsæt med at injicere Microfil indtil en kontinuerlig søjle fylder venerne. Fuldstændig fyldning vil være indlysende, når Microfil er kontinuerlige inden for beholderne, og det ud gennem PVC.
- Efter fyldning er fuldført, hurtigt stramme suturer, der tidligere var anbragt rundt om PVC og aorta for at forhindre den elastiske beskaffenhed af hjertevæv fra presse Microfil ud af beholderne.
- Dæk hjerte med våd gaze (vædet med vand fra dissekere bakken) For at forhindre udtørring og lade den sidde i ca 1 time ved stuetemperatur, indtil Microfil er polymeriseret. Undgå ydre pres på hjertet under polymeriseringsprocessen, såsom løft eller dreje hjertet i et forsøg på at få en tidlig udsigt over de fyldte skibe i bagsiden af hjertet. Dette kan klemme Microfil fra nogle fartøjer til en mere elastisk område af hjertet, forårsager brud på Microfil.
- Tag hjertet og post-ordne det i 4% PFA natten over ved 4 ° C. Derefter opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C. Hjertet vaskulatur er nu klar til μCT billeddannelse.
4. Repræsentative resultater
Fartøjer, der effektivt gennemblødning af Microfil vil have kontinuerlig, ubrudt Microfil gennem de fartøjer (fig. 3A). Omfanget af fyldning af koronarkar kan bedømmes med det blotte øje vener epicardially placeret 18, og kan let observeres (figur 3A, pilespids) arterier,som er mere intramyocardial 18, er også synlige gennem overfladen af hjertet (figur 3A, pil). Kapilarfyldning er også indlysende, da hjertevæv har en meget høj densitet af kapillærer, og derfor, når kapillærerne fyld vil hjertevævet flugter med farve Microfil (fig. 3A, stjerne). Således vil alle vaskulære netværk, som ikke har fylde være mærkbar på grund af manglen på Microfil (fig. 3B, C).
Diskontinuiteter i Microfil (asterisker i fig 3B) ofte forekommer, fordi den hydrofobe natur af Microfil vil få det til at optage i sig selv og forårsage "brud" i fyldte beholdere. Disse "pauser" kan reduceres, hvis trykket inden for de skibe, der opretholdes gennem ordentlig tie-offs af de vaskulære udgangspunkter fra hjertet. Andre diskontinuiteter kan være forårsaget af luftbobler i microfil. For at forhindre indførsel af luft, sørg for angiokateter er fuldt nedsænket i vand, når der skiftes fra perfusionen ap paratus til Microfil sprøjten. Hvis en luftboble indføres, kan det ofte kan fjernes ved simpelthen at fortsætte Microfil perfusionen indtil boblen er blevet skubbet gennem og ud af koronarkar.
Vaskulære netværk kan ikke fyldes helt, hvis en del af det vaskulære leje er blokeret (fig. 3B, pil). Mens Heparin hæmmer dannelsen af blodpropper, kan lejlighedsvis blokeringer stadig forekomme på grund af ufuldstændig Heparin perfusion forud for begyndelsen af proceduren, eller på grund af andre ukendte faktorer. Hvis en blokering forekommer, er der, så vidt vi ved, ikke fremgangsmåde til at fjerne det blokering at fuldføre vaskulære fyld. Ufuldstændig fyldning kan også blive resultatet, hvis for meget tryk anvendes under fyldning, idet Microfil ikke vil blive tvunget ind i alle kar og kapillære netværk (fig. 3C). Omvendt kan for meget tryk bevirke kapillærer til at briste og ekstravasere Microfil ind i det omgivende væv (Fig. 3D).
files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Oversigt over Microfil perfusion ordningen. (A) aorta og PVC er skåret på omtrent på niveau med membranen. (B) i aorta ascendens kanyleres med en angiokateter. (C) Vasodilatation puffer perfuseres gennem beholderne, drevet af trykket perfusion apparatet (ikke afbildet), mens (D) de tre afgrenes aortabuen ligeres. (E) 4% PFA perfuseres gennem blodpropper, medens både anteriore Vena Cavas ligeres. (F) med en sprøjte, der Microfil perfunderet gennem blodpropper, indtil det iagttages ud fra PVC.
Figur 2. Perfusion Apparatur. To Erlenmeyerkolber, hver fyldt med enten Vasodilatation buffer eller 4% PFA, er forbundet og tryk gennem rør er forbundet til deres sidevåben. Systemet sættes under tryk ved manuel pumpning afpære, og en trykmåler forbundet til en af kolberne til overvågning og opretholdelse af tryk. Små rør strækker sig gennem gummipropper og ned i væsken i hver kolbe. Trykket ind i de blanke pumper fluidet fra hver kolbe af disse mindre rør. Rørene derefter fusionere med en stophane, som kun tillader fluidum at strømme fra den ene kolbe ad gangen.
Figur 3. Prøv Microfilled hjerter. (A) fartøjer, der er fyldt og skal få (hvis nogen) pauser i Microfil og hjertevæv bliver farvet farven af Microfil følge den fyldte kapillærer (stjerne, og sammenligne med C). Begge arterier (pil - Venstre Anterior Faldende pulsåre) og vener (pilespids - Venstre Koronar Vein) er synlige gennem hjertet overfladen. (B) Et hjerte med pauser i microfil (stjerne) samt blokeringer i nogle fartøjer, der forhindrede komplet Microfil penetration. De blokerede kar forbliver rød (pil), idet blodet ikke blev skyllet ud under perfusion processen. (C) Et hjerte med fartøjer, der var ufuldstændigt udfyldt. Mærke vævet ikke har den gule farve af Microfil, angiver Microfil ikke trænge ind i kapillærerne. (D) En hjerte, hvor kapillærerne burst under fyldning, hvilket får Microfil at lække ind i det omgivende væv (pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjertevæv har en meget høj metabolisk behov, og derfor kræver en konstant tilførsel af næringsstoffer og oxygen fra blodet leveret af koronar vaskulatur. Sygdomme i koronarkar, som aftager koronar funktion på grund af skibet stenose og blokering, kan føre til hypoxi og iskæmi, og sætte de berørte patienter med risiko for myokardieinfarkt og uoprettelig skade på hjertemusklen. En bedre forståelse af den syge tilstand af disse fartøjer er nødvendig, og afgørende for vores evne til at studere koronarkar er visualisering af kar. Her præsenteres en fremgangsmåde til fremstilling af murine koronar vaskulatur til ex vivo billeddannelse ved at fylde karret med et stråleuigennemtrængeligt materiale. Denne protokol er specielt designet til at sikre fuldstændig fyldning, og efterfølgende visualisering af alle koronarkar, herunder kapillærer.
For at sikre fuldstændig fyldning af alle kapillærer, fyldning Agent, Microfil, skal injiceres i en delvis lukket system, der vil tvinge Microfil i de mindre og større modstand fartøjer inden for vaskulære netværk. For at oprette denne delvise lukning i vores in vivo påfyldning system, vi ligere de tre store, lave modstandskar forgrening fra aortabuen. Selvom dette ikke udelukker alle andre potentielle "lækage" point, de resterende fartøjer (først og fremmest den interkostale arterierne) er så små, at enhver tryktabet igennem dem forstyrrer ikke med fuldstændig fyldning af koronar vaskulære system. Når Microfil har perfunderet alle fartøjer i hjertet, vil den medfødte elastiske karakter af hjerte-kar-væv klemme Microfil ud af nogle fartøjer. At forhindre dette tab af Microfil vi ligere alle store og tilgængelig udgangssteder, nemlig både superior vena cavae, den bageste vena cava og aorta, efter koronar vaskulaturen helt perfunderet. På denne måde er trykket maintained i hjertet, indtil Microfil polymeriserer, så den Microfil at passe til beholderen struktur under normal fysiologisk blodtryk.
Alternativt, hvis visualisering af kapillærerne ikke er påkrævet, er det også muligt at fylde kun arterielle eller kun den venøse kar. Mere viskøse versioner af Microfil kan blandes med en høj viskositet fortyndingsmiddel (tilgængelig fra FlowTech). Mere viskøse perfusatet er i stand til at trænge ind i kapillærerne, og derfor tillader visualisering af kun de arterier, eller kun de vener, hvis perfunderes fra venesiden. Desuden fremlagde protokollen her kan nemt tilpasses til andre arter eller ikke-voksne mus. Skalering proceduren til passende svarer til størrelsen af dyret kræver blot, at kateteret og perfusionsslange er korrekt dimensioneret til dyrets aorta for at minimere lækage og forhindre strækning eller brud. Mængden af væske indsprøjtet (dvs. heparin,mættet KCl, og Microfil) skal også passende skaleres.
Vores protokol blev udviklet specielt til injektion af Microfil og billeddannelse af μCT, kan det imidlertid let tilpasses til andre fyldstoffer, enten for μCT analyse eller andre ex vivo-billeddannelse teknikker. Når man ser for μCT kompatible fyldstoffer, der er flere muligheder for røntgenfaste farvestoffer, så mange stoffer, der anvendes til påfyldning og studere vaskulaturen via andre billeddiagnostiske metoder (fx acryl) kan infunderes med radio uigennemsigtigt materiale, såsom en ledende pigment 9 eller en osmium-løsning 3. Uanset fyldning anvendte middel, μCT billeddannelse har den fordel, at resultaterne kan rekonstrueres i en 3D-model til at tilvejebringe vaskulære målinger samt strukturel information om forgrening mønster af de fyldte koronarkar 6,7,14,19. Hertil kommer, bevarer billeddannelse ved μCT det omgivende væv, hvilket giver mulighed for yderligere enalyses efter scanningen. Således kan fyldes, og scannes hjerter behandlet til histologisk analyse, og sektioner blev farvet for forskellige markører kan være på linie med μCT data til at korrelere arteriel / venøs identitet, tilstedeværelsen af glatte muskelceller lag eller flere histologiske indeks.
Andre almindelige vaskulære billeddannende teknikker kræver også vaskulær fyldning og vores protokol kan let tilpasses til perfusion af blodpropper med nogen af disse andre fyldstoffer. Scanning Electron Microscopy (SEM) kræver fyldning af fartøjerne og derefter opløse det bløde væv bort fra den etablerede vaskulær støbt i en proces, der kaldes korrosion støbning. For at opretholde formen af beholderne uden støtte fra det omgivende bløde væv skal fyldstof være stærk og ikke-skøre: ofte en acrylharpiks (f.eks MercOx, Batson s) 3,20,21. Mens SEM giver scanning resolutioner langt bedre end μCT billedbehandling 22, korrosions støbtening procedure ødelægger væv, hvilket forhindrer yderligere væv analyse. En anden fremgangsmåde til ex vivo billeddannelse af koronar vaskulatur, optiske projektionssystem Tomography (OPT) kan detektere synlige eller nær-synligt lys, og således muliggør detektering af fluorescerende signaler ud over chromogent præcipiterer som lilla bundfald fremstillet ved alkalisk phosphatase omdannelse af BCIP / NBT (5-brom-4-chlor-3-indolyl phosphate/4-nitro blue tetrazolium) 23-25. Visualisering af fartøjer, derfor kan opnås enten ved at fylde med et fluorescerende stof (f.eks PU4ii: en polyurethanharpiks 3 eller fluorescein infunderes dextran 26), eller ved ikke-fyldning metoder, såsom hel-mount immunodetektion via enten fluorescens eller en histokemisk kromogent præcipitat (f.eks BCIP / NBT) 23. OPT billeddannelse kan opnås opløsninger lidt bedre end μCT (omkring 1 mikrometer), men både fyldet og immunodeteAKTIONER fremgangsmåder det omgivende bløde væv skal være kemisk fjernes, hvilket kan forstyrre nogle antigener til histologisk analyse efter scanning.
Der er også adskillige fremgangsmåder til billeddannelse af koronare vaskulaturen, som ikke kræver vaskulær fyldning eller immunodetektion, og som sådan kan udføres in vivo. En teknik, Kontrast Forbedret High Resolution Ultrasound (CEHRUS), anvender gasfyldte mikrobobler som kontrastmiddel. Injektion af disse mikrobobler i blodet giver mulighed for visualisering af strømmen af blod med real-time flow målinger ned til kapillær niveau, men det giver ikke en 3D-visning af den afbildede skibe 2,27-31. En anden metode, har Magnetic Resonance angiografi (MRA) også blevet brugt til billede koronarkar 32-34, og de seneste fremskridt i MRA har udvidet billeddiagnostiske kapacitet til at opnå real-time blodstrømningshastigheder målinger 35,36. Mens MRA kan producere 3D-rekonstruktioner af vessels afbildes, løsning af MRA er i øjeblikket begrænset til omkring 100 mikrometer, og derfor undlader at identificere mindre fartøjer (kapillærerne, arterioler og venuler).
Idet både CEHRUS og MRA kan udføres på levende dyr, at de giver den fordel, gentagne gange og ikke-invasivt overvågning blodstrømning og vaskulær udvikling. Imidlertid relativt lav opløsning af MRA og manglen på 3D-funktionalitet fra CEHRUS hinder billeddannelse af koronar nettet som helhed. Således ex vivo billeddannelse teknikker, som kræver vaskulære fyldstoffer eller immunodetektions er vigtige for at opnå høj opløsning 3D information af koronar vaskulære system, medens in vivo-teknikker giver værdifuld information om funktionaliteten af det vaskulære netværk (dvs. strømdata) over tid . Kombinere in vivo tidsforløbsanalyse med slutpunktet ex vivo billeddannelse tilvejebringer et effektivt system til undersøgelse af koronar vaskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Mus blev behandlet med metoder, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Washington og i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr udgivet af det amerikanske National Institutes of Health (NIH publikation nr. 85-23, revideret 1996).
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kelly Stevens til indledende forsøg i protokollen, Dr. Michael Simons, Dr. Kip Hauch, og medlemmer af begge deres laboratorier til generel diskussion.
Dette arbejde er støtte fra NIH tilskud HL087513 og P01 HL094374.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes |  BD Biosciences |
BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | BD Biosciences |
BD-309306 | |
| 2" x 2" Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath IV catheter | BD Biosciences |
BD-381112 | |
| 26G ½"gauge needles | BD Biosciences |
BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich |
A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools |
11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile | Cardinal Health |
C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools |
14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon Instruments |
NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer |
YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap |
FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals |
NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher Scientific |
P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | FlowTech |
MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus |
723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. |
NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich |
P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools |
15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd, Inc. |
NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
