Summary
הפגנה של assay כמותית מהיר של עיכוב קרישת דם על ידי-הפרין נמוך משקל המולקולרי, enoxaparin. התרומה של enoxaparin מוערכת על ידי הסרת ההשפעה שלו דרך מערכת עיכול עם heparinase. תיאור מלא יותר של assay הוא מפורט במאמר שפורסם.
Abstract
יש צורך בבדיקה קלינית כדי לקבוע את המידה שבה הדם של מטופל anticoagulated ביעילות על ידי---הפרין הנמוך משקל המולקולרי (LMWH), enoxaparin. ישנם גם מצבים קליניים דחופים שבו יהיו חשוב אם זה יכול להיקבע במהירות. הבדיקה הנוכחית נועדה להשיג את זה. אנו assayed דגימות דם אדם שתובלו בריכוזים ידועים של enoxaparin בלבד. המאפיין המהותי של assay הנוכחי הוא כימות של היעילות של enoxaparin בדגימת הדם של מטופל באמצעות השפלתו להשלים עם חוסר הפעילות heparinase. שתי דגימות דם נשאב לתוך Vacutainer צינורות (קיטון-דיקנסון; פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי) שתובלו בenoxaparin; מדגם אחד היה מתעכל עם heparinase למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, המדגם האחר ייצג מעמד anticoagulated הבסיסי של החולה. קיצור האחוזים מזמן קרישה במדגם heparinase טופל, לעומת במדינת aseline, הניבה תרומת הקרישה של enoxaparin. אנחנו השתמשנו במכשיר הנייד, הסוללה המופעל Hemochron 801 למדידות של זמני קרישה (הבינלאומי Technidyne קורפ, אדיסון, ניו ג'רזי). המנגנון יש 2 (37 ° C) בארות צינור assay מבוקרים תרמוסטטית. ערכנו את המבחנים בשני סוגים של מחסניות assay שזמינים מהיצרן של המכשיר. מחסנית אחת שונה כדי להגביר את הרגישות שלו. הוצאנו את קאולין מFTK-ACT המחסנית על ידי שטיפה נרחבת עם מים מזוקקים, ומשאיר רק את משטח הזכוכית של הצינור, ואולי מגנט זיהוי, כמפעילים. קראנו assay זה הופעל מינימאלי (מאא). השימוש בבדיקה הופעלה מינימאלי נחקר על ידינו ואחרים. 2-4 המחסנית השנייה שלמדה הייתה assay (A104) זמן thromboplastin חלקי פעיל (aPTT). זה היה בשימוש כפי שסופק מהיצרן. בארות thermostated של המכשיר werדואר משמש הוא לעיכול heparinase ומבחני קרישה. הבדיקה יכולה להסתיים בתוך 10 דקות. Assay מאא הראה שינויים חזקים בזמן קרישה לאחר עיכול heparinase של enoxaparin מעל טווח ריכוז קליני טיפוסי. ב0.2 אנטי Xa IU של enoxaparin למ"ל של דגימת דם, עיכול heparinase נגרם ירידה ממוצעת של 9.8% (20.4 שניות) בזמן קרישה; ב1.0 IU למ"ל של enoxaparin הייתה ירידת 41.4% (148.8 שניות). דוח זה מציג רק את היישום הניסיוני של assay; הערך שלו בסביבה קלינית עדיין צריך לקום.
Protocol
1. כינון Heparinase
- heparinase Lyophilized אני מתקבל באופן מסחרי (סימנס, ניוארק דלוור, DadeHepzyme REF B4240-10) בבקבוקונים המכילים 1 מיקרוגרם של החלבון המטוהר. החלבון הוא מומס ב0.25 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).
2. איסוף דגימות דם
- שתי דגימות דם נמשכות על ידי ואקום לציטרט הנתרן (0.3 מ"ל 0.109M; 3.2%) נאגרה Vacutainer צינורות (קיטון דיקינסון-; פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי); הצינורות שניהם מראש מחוזקים איתי ריכוז ידוע של enoxaparin; נפח הדם כי הוא נמשך הוא 2.7 מ"ל. התוכן הכולל הוא אז 3.0 מ"ל.
3. עיכול Heparinase
- כל תכולתו של בקבוקון heparinase שעלול להישאף לתוך מזרק (כ -0.2 מ"ל, 80% מהבקבוקון; 0.8 מיקרוגרם של חלבון), עוברת לצינור Vacutainer אחד; 0.2 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) הוא הוסיף המבחנה השנייה, המשמשת כבאזלמדינת ine לפני נטרול השפעת enoxaparin.
- שני צינורות Vacutainer ממוקמים בבארות thermostated של מנגנון Hemochron לתקופה של 5 דקות. (הלימות זמן עיכול 5 דקות עם heparinase הוקמו בעבודה שלנו שפורסמה בעבר. 1)
4. מבחני קרישה
- בסוף דגירת heparinase, מיליליטר 2.0 של דם מועבר למחסנית assay. במקרה של צינור מאא, זה מראש מולא עם 0.1 מ"ל של 250 המ"מ CaCl 2 ליזום קרישה. המסחרית aPTT assay המחסנית (A104) נועדה ליזום קרישה בדם כולו שנמשכה לתוך צינורות Vacutainer המכילים ציטרט הנתרן כנוגד קרישה.
- מנגנון Hemochron מסמן את ההשלמה של קרישת דם ומשמר את זמני קרישה בשניות. ההבדלים בזמני קרישה בין מדגם heparinase טופל ומדגם המחקר, מחולקים בti הקרישהלהמדגם המחקר, מניב ירידת האחוזים כתוצאה מחיסול של enoxaparin. כפי שנראה להלן, מתאמים ליניארי חזקים הושגו על הקשר בין ירידה באחוז זמן קרישה והריכוז של enoxaparin בדגימות ממוסמרות של דם מלא, כמו גם למתאם עם ריכוזים מדודים של enoxaparin ידי assay chromgenic של אנטי Xa פעילות. מבחנים אנטי Xa של ריכוז enoxaparin נערכו עם ערכה מסחרית לבדיקת chromogenic שני שלבים (BIOPHEN; Aniara, מייסון, אוהיו).
Representative Results
איור 1 מציג את התוצאות ליחסים בין הירידה באחוז זמן קרישה בעקבות חיסול enoxaparin עם heparinase לסדרת ריכוזים ממוסמרים של enoxaparin (0.2, 0.4 ו -1.0 אנטי Xa IU למ"ל). תוצאות מוצגות לשניהם מאא ומחסניות assay aPTT. הריכוזים המדודים של enoxaparin מassay chromogenic של פעילות אנטי Xa כלולים גם בabscissa של כל חלקה.
איור 2 מציג את החלקות של אותם הנתונים כירידה באחוז זמן קרישה לעומת מדד chromogenic של פעילות אנטי Xa.
מתאמים חזקים ליניארי, עם משמעויות סטטיסטיות גבוהות, נמצאו לכל הארבע מערכות היחסים.
האיור 1. נקודה של קביעות טיפוח של enoxaparin contr ibution לזמני קרישה של דם כל קוצים המבוססים על אחוז השינוי (קיצור) זמן קרישה לאחר דגירה עם heparinase. ריכוזי enoxaparin הממוסמרים הוסיפו לכל דם והריכוזים אנטי Xa הפלזמה נמדדו (ממוצע ± SE, בסוגריים) ממוקמים בabscissa של כל גרף. כל שיעורי השינוי בזמני קרישה מוצגים כאמצעי וSE, יחד עם קיצור זמן הממוצע קרישה בשניות. נתונים מאותו המטופל מחוברים על ידי קווים מקווקווים. הנתונים לארבעת החולים שזוהו עם כוכביות בעלילה (תוצאות מאא) זהים לארבעה החולים בחלקה ב '(מבחני aPTT). כל התוצאות מייצגים קביעות יחידות. מקדמי מתאם פירסון r = 0.869 (p = 1.9 x 10 -5) וr = 0.916 (p = 2.8 x 10 -5) למערכות היחסים עם מאא וaPTTassay, בהתאמה. לשכפל באישור Inchiosa et al. 1
יפ-together.within עמודים = "תמיד"> 
. איור 2 התוצאות לשיעורי השינוי בזמני קרישה במבחני שלב של הטיפול מוצגים באיורי 1 א & B הם זממו נגד ריכוזי Xa נגד גורם פלזמה, תוצאות מאא;. B, aPTT מבחנים. כל התוצאות ממבחנים בודדים קרישת זמנים וקביעות יחידות של ריכוזי Xa נגד גורם. מקדמי מתאם פירסון r = 0.910 (p = 2.5 x 10 -6) וr = 0.922 (p = 2.0 x 10 -5) למערכות היחסים עם מאא וassay aPTT, לשכפל בהתאמה באישור Inchiosa et al. 1
Discussion
בדיקה זו של יעילות enoxaparin עשויה לשמש כאפשרות חשובה לקבוע את הבטיחות היחסית של ביצוע הליך פולשני שיש סיכון נלווה לדימום או לפיתוח של שטף דם. זה יהיה חשוב במיוחד כאשר זריקת אפידורל נשקלת. רוב ההנחיות ממליצות לתקופת מתנה של 12 שעות בין הזריקה של enoxaparin וייזום הליך פולשני ליקוי 5 כליות, השמנת יתר והריון עלול להשפיע על דרישות המינון של enoxaparin 6,7 מאז ניתן להשלים את מהלך הבדיקה בתוך 10.. - תקופת דקות, זה יכול לשמש גם במרפאה או במשרדו של הרופא, שבו יהיה לספק מידע על הלימות קרישה בחולים הנמצאים בסיכון להתפתחות של thromboembolism ורידים. התאמת מינון מיידית ניתן הנהיגה, לפי צורך.
ריכוז enoxaparin בפלזמה ניתן למדוד chromogenicssay של מידת עיכוב של גורם הקרישה, Xa. עם זאת, זה רק מניב ריכוזו, ולאו דווקא יעילות קרישתו, שמשתנית מאוד בין חולים בודדים. 6-8
המחקרים שלנו בוצעו רק עם enoxaparin. עם זאת, ניתן לצפות שהבדיקה יכולה להיות מיושמת על כל LMWH שהוא מושפל על ידי heparinase הראשון זה כבר ידוע להיות המקרה לdalteparin, nadroparin וtinzaparin. 9-11 עצבנו את assay ביחס לתכונות של מכשיר זמן קרישת Hemochron. המכשיר הוא זול יחסית; גם, צינורות דם חד פעמיים גבייה, אמפולה heparinase ומכלה assay כדי להשלים ניתוח למטופל אחד הוא כ 15 דולרים בארה"ב. לכן, זה יהיה צפוי להיות מתאים כדי לפקח על מצב קרישה במסגרות קליניות שונות.
Disclosures
המחברים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
החקירות בוצעו אך ורק עם תמיכה ממשאבים מחלקתיים ומוסדיים. מנגנון הקרישה (Hemochron 801) הושאל ללא התחייבות מהיצרן. מחסניות assay נרכשו בעלויות הקמעונאי שלהם. הדמות המקדימה בוידאו שונה מSanderink, et al. 12 הדמות השנייה בסרטון (כמובן זמן עיכול heparinase) שוחזרה באישור Inchiosa et al. 1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
