Summary
Denne metoden beskriver kombinatoriske syntese av biologisk nedbrytbart polyanhydride film og nanopartikkel biblioteker og high-throughput påvisning av protein utgivelse fra disse bibliotekene.
Abstract
Polyanhydrides er en klasse av biomaterialer med vevsvennligheten og levering av legemidler evner. Mens de har blitt studert med konvensjonell en-utvalgs-at-a-time syntese teknikker, har en nyere high-throughput tilnærming blitt utviklet slik at syntese og testing av store biblioteker av polyanhydrides en. Dette vil lette mer effektiv optimalisering og designprosessen av disse biomaterialer for narkotika og vaksine levering applikasjoner. Metoden i dette arbeidet beskriver kombinatoriske syntese av biologisk nedbrytbart polyanhydride film og nanopartikkel biblioteker og high-throughput påvisning av protein utgivelse fra disse bibliotekene. I denne robotically operert metode (figur 1), er lineære aktuatorer og sprøyte pumper kontrollert av LabVIEW, som muliggjør en hands-free automatisert protokollen, eliminere brukerfeil. Videre gjør denne metoden den raske fabrikasjon av mikroskala polymer biblioteker, røducing batch størrelse mens resulterte i etableringen av multivariant polymer systemer. Dette kombinatoriske tilnærming til polymer syntese forenkler syntese av opptil 15 forskjellige polymerer i en tilsvarende mengde tid det ville ta å syntetisere en polymer konvensjonelt. I tillegg kan polymer kombinatoriske biblioteket bli fabrikkert i blanke eller protein-loaded geometrier inkludert filmer eller nanopartikler Ved oppløsning av polymeren biblioteket i et løsningsmiddel og nedbør inn i en ikke-oppløsningsmiddel (for nanopartikler) eller ved vakuumtørking (for filmer). Etter lasting en fluorokrom-konjugert protein inn i polymeren bibliotekene kan protein frigivelse kinetikk vurderes ved høy gjennomstrømning ved hjelp av en fluorescens-basert deteksjonsmetode (figurene 2 og 3) som beskrevet tidligere 1. Dette kombinatoriske plattformen har blitt validert med konvensjonelle metoder 2 og polyanhydride film og nanopartikkel bibliotekene har vært preget med
Protocol
1. Kombinatorisk Polymer Library Synthesis (Varierende i Polymerkjemi) - se figur 1 for Robotic Setup
- Oppløs hver monomer i passende oppløsningsmiddel (konsentrasjon = 25 mg / ml) og laste hver inn i en 10cc gasstett sprøyte.
- Fest løsemiddelbestandig lokke lås kapillarrør til slutten av hver sprøyte.
- Plasser sprøyter på sprøyten pumper (New Era Programmerbare sprøyte pumper) og låses i posisjon.
- Still lineære aktuatorer (Zaber) til startposisjon.
- Bruke ring stativ klemmer, posisjonere enden av begge kapillarrørene som startpunkt ampulle / brønn for monomer deponering.
- Initiere LabVIEW programmet, som pumper variable volumer av hver monomer i hver brønn avhengig av ønsket kopolymer sammensetningen. Dette er oppnådd i programmet ved å instruere den Z-aksen aktuator å senke kapillarrørene i hetteglasset / brønn og deretter hver pumpe å dispensere det ønskede volum. Next, instruerer programmet Z-aktuatoren for å returnere til sin utgangsposisjon og X-og Y-aktuatorer å flytte til posisjonen til neste ampulle / godt. Dette utføres før hver brønn har det ønskede volum av monomer deponert inn i den.
- Etter monomer deponering, er multi-brønn eller multi-ampulle monomer biblioteket overført til en forvarmet vakuumovn og inkubert under vakuum for varigheten av kondensasjonsproduktet polymerisasjonsreaksjonen. For CPH: SA syntese reaksjonen utføres ved 180 ° C, 0,3 torr, for 1,5 hr men disse reaksjonsbetingelsene vil variere mellom ulike polymer-systemer.
2. Kombinatorisk Blank og Protein-loaded Polymer Nanopartikkel og filmbibliotek Fabrication - se figur 1 for Robotic Setup
- Sprøyten i den første programmerbare sprøytepumpen er fylt med et løsningsmiddel (tom biblioteket) eller et oppløsningsmiddel med protein dispergert i det (protein-loaded biblioteket) mens sprøyten i den andre sprøytePumpen er tomt. Rør for nanopartikkel fabrikasjon i tilstøtende prøveholderen er fylt med det ikke-oppløsningsmiddel (forholdet oppløsningsmiddel til ikke-løsningsmiddel er fra 1 til 100). For film fabrikasjon en tom multi-brønns plate benyttes i stedet for rørene i den tilstøtende prøveholderen.
- Bruke LabVIEW programmet, løsningsmidlet deponert i alle polymer ampuller / brønner av biblioteket (konsentrasjon = 20 mg / ml) og inkubert i 1-5 minutter. En valgfri lydbehandlingstrinn (30 s ved 40 Hz) kan bli innført for å sikre fullstendig polymer oppløsning.
- Neste, ved å initiere en separat LabVIEW program, er prøven trukket inn i den tomme sprøyten, og satt inn på den tilsvarende rør av ikke-løsningsmiddel (nanopartikler) eller tom brønn (filmer) i tilstøtende prøveholderen.
- Denne prosessen blir utført for hver sammensetning av den diskrete polymer biblioteket.
- Nanopartikkel eller film biblioteket blir så plassert i et vakuumkammer for løsemiddel og ikke-løsemiddel fjerning (nanopartikkel library kan også utvinnes ved hjelp av vakuumfiltrering).
3. Høy gjennomstrømming Protein utslipp Kinetics
- For å undersøke høy gjennomstrømming protein frigivelse kinetikk fra en polymer bibliotek, 96 dyp-vellet (2 ml / brønn), er polypropylen plate modifisert slik at den øverste 1/3 av brønnveggen i nærliggende kolonner (ex: A og B, C og D, E og F, G og H) er fjernet for å arknummer brønnene. De protein-loaded filmene må være fabrikkert i eller nanopartikler overført til denne platen til å utføre høy gjennomstrømming frigjøring kinetikk studier. Protein-loaded nanopartikkel eller film prøvene må kun settes i en brønn av de tilstøtende kolonner (ex: A, C, E og G). Se figur 4 for detaljer.
- Etter overføringen av nanopartikler til 96 dype vellet utgivelse plate, blir partiklene fikk bunnfelle. PBS-buffer (0,1 mM, pH 7,4) blir langsomt tilsatt til hver prøvebrønnen (kolonne A, C, E og G) og deretter til hver nærliggende brønn (kolonnene B, D, F og H) inntil brønnene er fulle og bufferen er frittstrømmende mellom tilstøtende brønner. For nanopartikler, må denne prosessen utføres med ekstra forsiktighet for å sikre at partiklene forblir i bunnen av prøvebrønnen (kolonnene A, C, E og G) og ikke overført inn i tilstøtende utgivelsen brønnen (kolonnene B, D, F og H). I noen tilfeller, er sentrifugering kreves å lokalisere nanopartikkel prøvene nederst prøvebrønnen (kolonnene A, C, E og G).
- Det neste er at utgivelsen plate forseglet med et lokk og som er lagt inn på den ønskede temperatur (dvs. 37 ° C) under omrøring for varigheten av eksperimentet.
- Hos inkrementelle tidspunkter (0,04 dvs. 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, og 30 dager) mengden av frigjort fluorokromkonjugerte konjugert protein kvantifiseres en 9400 Typhoon Flatbed Fluoriserende Scanner ( GE Healthcare). Utgivelsen plate er plassert på skanneren overflaten, skannet med riktig eksitasjon laser og utslipp filters, og fluorescensintensiteten av det frigitte proteinet i frigivelsen brønnene (kolonnene B, D, F og H) er kvantifisert (Bilde Quant). Er det foreslått at protein standarder av kjente konsentrasjoner inngå i brønnplate for beregning protein antall og regnskapsføring fluorokrom bråkjøling.
4. Representant Resultater
Ved fabrikasjon av polymeren biblioteket har karakterisering er utført med 1H NMR, GPC, og FTIR å validere denne kombinatoriske metoden 1,7,8,11. Molekylvekter varierer fra 10,000-20,000 g / mol, polydispersitetsindeks spenner 1,5 til 3,0, og kjemisk sammensetning har vist seg å være nøyaktig og i overensstemmelse med konvensjonelle metoder for syntese polyanhydride 12-15. Tilsvarende viste SEM bilder av nanopartikler bibliotekene lignende overflate morfologi, størrelse og størrelsesfordeling som for konvensjonelt fabrikerte nanopartikler 2. Protein utgivelsen kinetics fra polyanhydride nanopartikler eller filmer er utført i en modifisert brønnplate som beskrevet tidligere 1. Resultatene viste en omtrentlig nullte orden utgivelse med eller uten en burst avhengig protein lasting og polymerkjemi (Figurene 2 og 3) 1,12,14,16.
Figur 1. Kombinatorisk polymer film og nanopartikkel fabrikasjon apparat.
Figur 2 Høy throughput utgivelsen av Texas Red bovinserumalbumin (TRBSA) fra en CPH:. SA polymer nanopartikkel biblioteket. SA-rike polymer kjemikalier slipper innkapslet TRBSA den raskest, mens CPH-rike polymer kjemikalier slipper den tregeste. Feilfelt representerer standardavviksjon og n = 4. Gjengitt med tillatelse fra Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figur 3. Høy throughput utgivelsen av Texas Red bovinserumalbumin (TRBSA) fra en CPTEG:. CPH polymerfilm biblioteket. CPTEG-rike polymer kjemikalier slipper innkapslet TRBSA den raskest, mens CPH-rike polymer kjemikalier slipper den tregeste. Feilfelt representerer standardavvik og n = 3.
Figur 4. Bildet viser to nabokommunene brønner "før" og "etter" endring i 96 dype vellet polypropylen plate. "Etter" modifisering bildet til høyre viser også tillegg av en polymerfilm (bunnen av venstre brønn) med en innkapslet fluorescerende molekylblir utgitt mellom de to brønnene i en bufferoppløsning. Den frigjorte fluorescerende molekyl blir så detektert i riktig godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kjennskap nødvendige syntese forhold og glass omvandlingstemperaturer (T g) av polymerer blir syntetisert er avgjørende for biblioteket fabrikasjon. Dersom T g s er under romtemperatur, kan nanopartikkel fabrikasjon trinnet må utføres i en kontrollert temperatur miljø under T g av polymerene. I tillegg bør forsiktighet tas for å sikre at alt utstyr som kommer i kontakt med høye temperaturer og løsemidler må være skikket til å håndtere disse forholdene. Flere av parametrene i denne protokollen kan justeres (dvs. temperatur, vakuum, inkubasjonstider, løsemidler, uten-løsemidler, polymerkonsentrasjon, løsemidler til ikke-løsningsmiddel forholdstall, etc.) for å imøtekomme forskjellige polymersystemer for syntese eller partikkel / film fabrikasjon. I noen tilfeller, nanopartikler er ikke stabile i løsningsmidler for lengre tidsperioder (tilstrekkelig for fjerning av løsningsmiddel ved vakuumtørking) så to alternerende oppløsningsmiddel removale metoder kan brukes. 1) Partiklene kan være langsomt sentrifugert, supernatanten oppløsningsmidlet dekantert, og de gjenværende partikler tørket eller 2) ved at partiklene kan separeres ved vakuumfiltrering og deretter tørket. Etter fabrikasjon av tomme eller protein-loaded nanopartikler / film, high-throughput karakterisering eller testing kan gjennomføres for å undersøke om biomaterialer for protein, mobilnettet, eller vert interaksjoner. Dette high-throughput metodikk muliggjør rask optimalisering av biomateriale ytelse for ønsket program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) og US Army Medical Research og forsyningskommando Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) for økonomisk støtte. Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation i henhold Grant No EEC 0552584 og 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
