Articolo metodologico

Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando

DOI:

10.3791/3891

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20 febbraio 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

In questo articolo

Sommario

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Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano 18 O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo), 18 O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell'ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro, 18 O-atomi sono introdotti da scambio di ossigeno carbossile a pH basso.

Abstract

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Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l'avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l'acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine ​​(recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un'alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l'incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l'adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l'essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l'analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l'incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali "doppio" etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l'etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.

Protocollo

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Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine ​​e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettrometria di massa e la rappresentazione grafica di 18-O incorporazione cinetica.

A. TimeCourse Esperimenti

I. Paleo-TimeCourse: Proteasi-catalizzata etichettatura dei cleavages proteolitici

  1. (Opzionale) legami disolfuro di proteine ​​(10 mM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale 2.5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (sia preparata) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C.
  2. (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
  3. A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare PepClean colonne C-18 di spin (Thermo) per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori (Sartorius) per scambiare i buffer per campioni di proteine.
  4. Ridisciogliere / peptidi / proteine ​​di cambio in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell'aggiunta della proteasi: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamicoacido matrice (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Caricare il campione su un Opti-TOF 384 piastra segnale MALDI (AB SCIEX) e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 minuti).
  6. Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con la proteasi di interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura raccomandata per il particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come campione di controllo. La prima aliquota rappresenta un campione standard di proteasi-catalizzata 18 O-etichettatura e può essere utilizzato per l'identificazione di peptidi e proteine, rilevamento di attività proteolitiche e monitoraggio delle reazioni di scissione proteolitica. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è indotta dalla proteasi, quindi, né etichettatura né scissione è prevista per questo esempio.
  7. Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come described sotto passaggio 5 a intervalli di tempo, come sembra in forma. Le condizioni di reazione descritte sopra sono usati per controllare una reazione proteolitica fino a quattro giorni (circa 24 punti). Avviare il campionamento ogni 5 min fino al 30 min, quindi individuare ogni 30 minuti fino a 2 ore, poi ogni ora fino a 8 ore e ogni 8 ore fino a 4 giorni. Prodotti di scissione dovrebbe apparire entro i primi 12 ore e il supporto deve essere completamente idrolizzato dopo 24 ore. Estesa tempi di incubazione di reazione permettono di definire i prodotti di reazione stabili che sono discreti da intermedi di reazione, che vengono ulteriormente elaborati. Seconda domanda di ricerca e di proposta enzima-substrato coppie, i tempi di individuazione e temperatura di incubazione devono essere modulata per assicurare campionamento ottimale reazione.
  8. Dopo l'ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistamento, la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B).

II. Paleo-TimeCourse: Postdigetichettatura estion di Termini proteolitici

  1. (Facoltativo) legami disolfuro di proteine ​​(10 pM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale di 2,5 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 (entrambi preparati) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C.
  2. (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
  3. A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare le colonne PepClean C-18 di spin per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori per lo scambio delle proteine ​​buffer.
  4. Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici / proteine ​​in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi tripsina (es: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digerire con proteasi di interesse al completamento (es. tripsina: 0,04 nM; 37 ° C, 12 ore).
  5. Scissione Cleanup con colonne PepClean C-18 di spin. Questo passo sarà eliminare le attività residue della proteasi.
  6. Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 O. 18
  7. Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell'aggiunta di enzima: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Spot campione su una piastra MALDI e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 min).
  8. Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con proteasi di interesse (ad esempio tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura consigliata per la particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come controllo. Il primoUn'aliquota rappresenta un campione standard per proteasi-catalizzata 18 O-postdigestion etichettatura e può essere utilizzato per la quantificazione delle proteine ​​e peptidi. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è catalizzata dalla proteasi, pertanto, alcuna etichettatura è prevista per questo esempio.
  9. Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come descritto al punto 7.) Ad intervalli di tempo, come sembra in forma. Per esempio, abbiamo scoperto inizialmente ogni 5 minuti fino a 30 minuti e ogni 15 minuti dopo che per monitorare il carbossile reazione di scambio di ossigeno catalizzata da tripsina.
  10. Dopo l'ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistare la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B).

III. Aleo-TimeCourse: acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici

  1. Incubare singoli peptidi (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-acqua arricchita in tegli presenza o assenza (controllo) del 0,1% (v / v) finale di acido trifluoroacetico (volume totale 30 microlitri).
  2. I prodotti di reazione del campione al giorno per 48 giorni per co-spotting una aliquota 0,5 microlitri della miscela con 0.5μl di alfa ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% TFA) direttamente su un bersaglio MALDI piastra.
  3. Tra gli intervalli di spotting e dopo aver individuato il punto finale tempo di reazione presenta una piastra segnale per MALDI-TOF/TOF MALDI MS / MS, come descritto di seguito nella sezione B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS di acquisizione dati e analisi

  1. Gli spettri di massa sono invece acquistati su MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Prima dell'analisi, lo strumento è tarato con una miscela di standard peptide (Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti), con una tolleranza massima di errore di massa di misura di ± 50 ppm e un numero minimo di sei picchi da abbinare.
  3. MS (range di massa400 - 4.000 m / z) sono acquisiti in triplice copia utilizzando la modalità di ioni positivi con una intensità del laser regolabile (3.400 - 3.800; passo di 50) con un accettabile campo di intensità base del picco di 2.000 - 45.000. Scatti singoli vengano acquistate per sub-spettri, con 400 colpi totali / spettro, stop condizioni entreranno in vigore dopo 800 sub-spettri vengono acquisiti (positivo o negativo) o 400 sub-spettri criteri di accettazione passaggio. In caso di bassa abbondanti campioni o in presenza di complessi ambienti biologici l'estremità inferiore del campo di rilevamento MS dovrebbe essere portato a 800 m / z. Inoltre, può essere necessario rimuovere sale e altri composti che interferiscono con un passo di pulitura campione come descritto in precedenza, o mediante separazione LC.
  4. MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla serie 4000 di acquisizione dati e software Explorer importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, che utilizza il software Distiller MASCOT (Matrix Science) per l'elaborazione spettrale e il rilevamento di picco. Buste isotopichesono deconvoluto e 18 O-incorporazione coefficienti determinati automaticamente utilizzando un algoritmo simile a quello descritto da Mason et al. 12 e adattato dal nostro gruppo 9. Alternativamente, strumenti software come ZoomQuant Viper 13 e 14, nonché pacchetti software commerciali quali come Bioworks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Mascot Distiller quantificazione Toolbox (Matrix Science) può deconvolute 18 O-tipo di dati 15,16. 18 O-incorporazione rapporti sono espressi come i contributi relativi delle singole specie isotopi peptide (cioè, peptidi contenenti almeno il 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) per la busta isotopica.
  5. Per ogni esperimento TimeCourse, le masse molecolari ([M + H] +) per tutte le specie peptidiche rilevati vengono estratti dai file di dati associati MS ed i valori categorizzata in una larghezza 100 ppm di massa.
  6. Lat almeno tre [M + H] + sono impostati per essere tenuti a compilare un bidone. Nel caso di supporti noti, l'elenco bin filtrato viene confrontato con l'elenco dei prodotti di scissione proteolitica previsto dalla sequenza di peptide substrato utilizzando lo strumento ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) e 200 ppm di massa tolleranza di errore di accettazione.
  7. MS / MS sono acquisiti per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione previsti dallo strumento FindPept e per valori bin che hanno 18 O-incorporazioni essi associati. MS / MS dati sono stati acquisiti in MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer in modalità riflettore 1 kV ione positivo, con una intensità del laser fissa di 4200 e CID-gas in modalità off. 50 scatti vengono acquisiti in un modello randomizzato per ogni sub-spettri fino a un totale di 40 sotto-spettri per spot (producendo un totale di 2.000 scatti / spot).
  8. MS / MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla Serie 4000 Explorer software di acquisizione dati e importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, i picchi vengono rilevati e MS / MS liste di punta sono associati con i corrispondenti dati raggruppate MS.
  9. Per l'identificazione peptide, MS / MS liste di picco sono confrontati con il database SwissProt utilizzando il motore di ricerca MASCOT con i seguenti parametri di ricerca: nessuna specificità dell'enzima, 150 ppm di ione precursore e 0,2 Da frammento tolleranze di massa di ioni.
  10. Identificazioni peptidi possono inoltre essere convalidati utilizzando il software Data Explorer (AB SCIEX) confermando le caratteristiche 18 O-incorporazione modelli in tutto y serie frammenti ionici come descritto da Shevchenko et al. 18.

C. Preparazione del Tempo spettrale e 18 O-incorporazione Personaggi

Grafici spettrali tempo: MS file di dati (. T2D file) per ogni punto il tempo di reazione vengono esportati dal software Data Explorer come ASCII-file utilizzando unmacro e importato in un programma di analisi dei dati e software di grafica (ad esempio origine OriginLab) e visualizzati come grafici a cascata (Figura 3).

18 O-incorporazione piazzole: Per ogni prodotto peptide cestinate scissione, dei contributi delle singole specie isotopi peptide (16 O 18 O 18 O 1 o 2) vengono estratti attraverso punti di tutti i tempi di reazione e funzione del tempo (Figura 4).

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Risultati

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Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l'incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L'approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel te...

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Discussione

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Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente ril...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Denominazione del prodotto Azienda Numero di catalogo
Colonne PepClean C-18 Spin Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI obiettivo piastra AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF AB SCIEX

Tabella 1. Materiali

Nome del reagente Azienda Numero di catalogo
Alfa ciano-4-idrossicinnamico acido Sigma Aldrich 70990-1G-F
Albumina di siero bovino (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Ditiotreitolo (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
L'endotelina-1 enzima di conversione (ECE-1) R & D Systems 1784-ZN
Tripsina Oro Promega V5280
Acqua-18 O, 97% atomo 18 O Sigma Aldrich 329878-1G
Acido trifluoroacetico (TFA) Thermo 28904
Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti AB SCIEX 4333604

Tabella 2. Reagenti

Riferimenti

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  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
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  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
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  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

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