Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano 18 O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo), 18 O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell'ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro, 18 O-atomi sono introdotti da scambio di ossigeno carbossile a pH basso.
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Articolo metodologico
Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando
In questo articolo
Sommario
Abstract
Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l'avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l'acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine (recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un'alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l'incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l'adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l'essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l'analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l'incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali "doppio" etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l'etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.
Protocollo
Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettromet....
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Risultati
Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l'incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L'approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel te.......
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Discussione
Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente ril.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Denominazione del prodotto | Azienda | Numero di catalogo | |
| Colonne PepClean C-18 Spin | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI obiettivo piastra | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF / TOF | AB SCIEX |
Tabella 1. Materiali
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo |
|---|---|---|
| Alfa ciano-4-idrossicinnamico acido | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Albumina di siero bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Ditiotreitolo (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| L'endotelina-1 enzima di conversione (ECE-1) | R & D Systems | 1784-ZN |
| Tripsina Oro | Promega | V5280 |
| Acqua-18 O, 97% atomo 18 O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Thermo | 28904 |
| Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti | AB SCIEX | 4333604 |
Tabella 2. Reagenti
Riferimenti
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H.
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Ristampe e permessi
