Articolo metodologico

In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

DOI:

10.3791/3973

⸱

5 agosto 2012

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1Department of Plastic and Hand Surgery, University of Freiburg Medical Centre

In questo articolo

Sommario

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Digital microscopia intravitale epifluorescenza delle venule postcapillari nella microcircolazione cremasterico è un metodo comodo per acquisire conoscenze in leucociti-endotelio In vivo In ischemia-riperfusione (IRI) del tessuto muscolare striato. Noi qui forniamo un protocollo dettagliato per eseguire in sicurezza la tecnica e discutere le sue applicazioni e limitazioni.

Abstract

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L'ischemia-riperfusione (IRI) è stata implicata in una vasta gamma di condizioni patologiche come ictus cerebrale, infarto del miocardio, ischemia intestinale così come a seguito di trapianto e chirurgia cardiovascolare. 1 riperfusione di tessuto precedentemente ischemico, mentre essenziale per la prevenzione di irreversibile lesione dei tessuti, provoca infiammazione eccessiva del tessuto colpito. Adiacente alla produzione di specie reattive dell'ossigeno, l'attivazione del sistema del complemento e aumento della permeabilità microvascolare, l'attivazione di leucociti è uno degli attori principali nella cascata patologica del danno tissutale infiammatorio durante la riperfusione. 2, 3 attivazione dei leucociti è un processo multifasico che consiste di laminazione, adesione e la ferma ed è mediata da una complessa interazione tra molecole di adesione in risposta a fattori chemiotattici quali fattori del complemento, chemochine, o fattore attivante le piastrine 4. <p class = "jove_content"> Mentre rolling leucociti in venule postcapillari è mediato principalmente dall'interazione di selectine 5 con loro ligandi contatore, ferma adesione dei leucociti all'endotelio selectina è controllato tramite legame a molecole di adesione intercellulare (ICAM) e vascolare cellulari molecole di adesione (VCAM) 6, 7.

Gold standard per l'osservazione in vivo di leucociti-endotelio è la tecnica della microscopia intravitale, descritta per la prima nel 1968 8.

Benché vari modelli di IRI (ischemia-riperfusione) sono stati descritti per vari organi, 9-12 solo pochi sono adatti per la visualizzazione diretta del reclutamento di leucociti nel microcircolo a un alto livello di qualità dell'immagine. 8

Abbiamo qui promuovere la microscopia digitale intravitale epifluorescenza del venule postcapillari del microcircolo cremastericodel ratto 13 come un metodo conveniente per analizzare qualitativamente e quantitativamente il reclutamento dei leucociti per la ricerca IRI-nel tessuto muscolare striato e fornire un manuale dettagliato per realizzare la tecnica. Abbiamo inoltre illustrare le insidie ​​più comuni e fornire consigli utili che dovrebbe consentire al lettore di apprezzare veramente, e sicuro di eseguire il metodo.

In un passo dal protocollo passo che raffigurano come iniziare con l'anestesia respirazione controllata sotto il controllo sufficiente a mantenere l'animale saldamente anestetizzato per lunghi periodi di tempo. Abbiamo poi descrivere la preparazione cremasterico come un sottile foglio appartamento in eccellente risoluzione ottica e fornisce un protocollo per l'imaging dei leucociti in IRI che è stato ben stabilito nei nostri laboratori.

Protocollo

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1. Anestesia e monitoraggio

  1. Etico competente nazionale e istituzionale dovrebbe essere a posto prima di effettuare esperimenti su animali. Dopo l'approvazione al comitato etico anestetizzare ratti Sprague Dawley maschi con un peso corporeo 120-180 g. Consegna 2 - 3% vol isoflurano a una finestra di plexiglas con vaporizzatore isoflurano e posizionare all'interno ratto.
  2. Non appena il livello adeguato di anestesia si ottiene (mancanza di reazione a punta o la coda pizzico), il ratto è ponderato e rasato l'area ventrale del collo dell'utero.
  3. Posizionare il ratto in decubito dorsale su un tappetino di riscaldamento per mantenere la temperat....

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Discussione

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Leucociti-endotelio, la produzione di specie reattive dell'ossigeno e l'attivazione del sistema del complemento sono le caratteristiche principali di IRI indotta disfunzione tessuto. 26 La microcircolazione del tessuto colpito è considerato come il sito integrale per l'insorgenza infiammatoria. A parte gli esperimenti ex vivo come test camera di flusso 27, 28, è obbligatorio fornire consolidati modelli di imaging intravitale di valutare ulteriormente la rilevanza in vivo.

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Dichiarazioni

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione del "Deutsche Forschungsgemeinschaft" a SU Eisenhardt (EI 866/1-1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del prodotto: Società: N. di catalogo: Commenti:
Forene 100% (V / V) Abate B506 API isoflurane
Terylene sutura Serag Weissner OC108000
Portex Belle Bore tubi in polietilene Smiths Medical 800/100/100 0,28 mm diametro interno
0,9% soluzione salina Fresinus Kabi 808771
Change-A-tip deluxe kit cautery Bovie Medical Del1
Abbocath-T 14G Venisystems G713- A01 utilizzato come tubo lente
Servo Ventilatore 900C Maquet utilizzati come ventialtor animale
Trasduttore di pressione Logical Smiths Medical MX1960
Sirecust 404 Monitor Siemens
ABL 700 da banco Analyzer Radiometro per la misurazione del gas sangue
Riscaldamento pad Effenberger 8319
Alluminio stage ALFUN AW7022
Chirurgica microscopio OPMI 6-SDFC Carl Zeiss
Microchirurgica strumenti di laboratorio set S & T 767
Biemer nave Clip Diener 64,562
L'applicazione di forcipe Diener 64,568 per clip nave Biemer
Rodamina 6G Sigma-Aldrich R4127
Vaselina bianca DAB Winthrop 2726853
Coprire gli occhiali 32x32 millimetri
Installazione intravitale
Zeis Axio Scope A-1 MAT Carl Zeis 490036 microscopio a epifluorescenza
470 nm LED Carl Zeis 423052 fluorescenza sorgente luminosa
Colibri 2 Sistema Carl Zeis 423052
W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC Carl Zeis 421452 immersione in acqua obiettivo
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire Carl Zeis 426509 fotocamera digitale ad alta risoluzione
Axio LE vision software Carl Zeis 410130 utilizzare per l'analisi offline

Riferimenti

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  1. Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
  2. Granger, D. N.

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Tag

Microscopia intravitaleimaging dei leucocitianestesia a respirazione controllatacanulazione della vena giugulareosservazione delle venule post capillariquantificazione del rolling dei leucociticonteggio dei leucociti aderenti

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