Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.
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Articolo metodologico
Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modelli animali di malattie umane sono necessarie per studiare rigorosamente fasi della progressione della malattia e meccanismi associati, e infine, come modelli pre-clinici per testare interventi. In questi metodi, si descrive una tecnica in cui il lipopolisaccaride (LPS) è iniettato nel topo ghiandola mammaria in allattamento tramite il beccuccio, efficace modellazione mastite, o infiammazione, della ghiandola. Ciò si traduce in una maggiore infezione simulati fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, come visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter luciferasi 1.
Il nostro obiettivo finale nello sviluppo di questi metodi era quello di studiare l'infiammazione associata con mastite nella ghiandola in allattamento, che spesso include arrossamento, gonfiore, e infiltrazione di cellule immunitarie 2,3. Pertanto, eravamo consapevoli che incisione o qualsiasi tipo di ferite della pelle, il capezzolo, o la ghiandola per introdurre i LPS possono fermarsinon essere utilizzati nei metodi poiché l'approccio sarebbe probabilmente confondere il read-out di infiammazione. Abbiamo anche voluto uno straight-forward metodo che non ha richiesto appositamente realizzati disegnati a mano pipette o l'uso di micromanipolatori di detenere tali strumenti specializzati in atto. Così, abbiamo deciso di utilizzare una siringa da insulina disponibile in commercio e per iniettare l'agente nel condotto mammaria di un capezzolo intatta. Questo metodo ha avuto successo e ci ha consentito di studiare l'infiammazione associata con iniezione di LPS assenza di effetti addizionali sovrappone il processo di iniezione. Inoltre, questo metodo anche utilizzato un NF-kB reporter di luciferasi di topo transgenico e bioluminescente tecnologia di imaging per mostrare visivamente e quantitativamente maggiore NF-KB di segnalazione all'interno della ghiandola iniettato LPS-4.
Questi metodi sono di interesse per i ricercatori di molte discipline che desiderano malattia modello all'interno della ghiandola mammaria durante l'allattamento, in quanto in ultima analisi, la tecnicaqui descritto potrebbe essere utilizzato per l'iniezione di un certo numero di sostanze, e non è limitato a solo LPS.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Vanderbilt University e del Comitato Istituzionale uso.
1. Preparazione di topi transgenici
- Topi femmina, positivo per la (N F-kB-G FP-L uciferase) giornalista transgene NGL (descritto in precedenza 1) vengono utilizzati per questa procedura. Quando le femmine sono almeno 6 settimane di età, li accoppiarsi con un maschio FVB tipo selvatico. Harem di allevamento possono essere utilizzati (fino a 4 femmine in una gabbia con 1 maschio). (Nota: topi FVB ceppo sono stati utilizzati per lo studio attuale topi ceppo scuri come C57Bl6 p....
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Discussione
Qui ci avvaliamo di un transgenico NF-kB topo giornalista e una tecnica di iniezione ottimizzata per mastite modello, infiammazione del tessuto mammario più comunemente causata da un'infezione batterica. La fase più critica in questa procedura è la stessa iniezione intraduttale.
In pratica, di solito è evidente se l'iniezione intraduttale ha avuto successo. L'iniezione di agenti (LPS o PBS) dovrebbe sentire fluido e ci dovrebbe essere poca o nessuna resistenza come la siringa vie.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH CA113734 assegnato a F Yull e il Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Lipopolisaccaride da Escherichia coli (LPS) | Sigma | L 2880 | sierotipo 055: B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 gauge siringa da insulina | Becton Dickinson | 328438 | Ago corto |
| Forcipe | Mondo Strumenti di precisione | 15908 | |
| Dissezione portata | Leica | M3Z | |
| Terrell isoflurano, USP | MINRAD INC per Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 sistema di imaging | Pinza (ex Xenogen) | N / A | |
| Siringa per iniezione luciferina | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5 / 8 |
| D-Luciferin Firefly, sale di sodio monoidrato (Substrato Luciferin) | Biosynth Chimica e Biologia | L-8240 | Diluire a 10 mg / ml |
Riferimenti
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E.
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Ristampe e permessi
