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Articolo metodologico

Colorazione immunoistochimica di B7-H1 (PD-L1) in paraffina incorporate diapositive di tessuto pancreatico Adenocarcinoma

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DOI:

10.3791/4059

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3 gennaio 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

B7-H1 (PD-L1) e il suo legame al PD-1 forniscono una maggiore tumore segnale indotto immunosoppressiva nel microambiente del tumore. Una tecnica di colorazione immunoistochimica per caratterizzare l'espressione e la localizzazione di B7-H1 in adenocarcinoma pancreatico è descritto qui.

Abstract

B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine ​​di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8.

Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l'importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per il mulgestire più tumori umani solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12.

Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l'espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell'immunità antitumorale in microambiente del tumore. L'anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo devfuggita la B7-H1 protocollo di colorazione per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po 'di storia.

Protocollo

B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine ​​di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8.

Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l'importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per l'uomo piùtumori solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12.

Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l'espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell'immunità antitumorale in microambiente del tumore. L'anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo sviluppato la B7-H1 stainiprotocollo ng per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po 'di storia.

1. De-parafinization

  1. Bake scorre a 55 ° C per 20 min.
  2. In una cappa chimica, immergere i vetrini in xilolo per 10 min.
  3. Immergere i vetrini in xilene fresco per 10 minuti.
  4. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min.
  5. Immergere i vetrini in etanolo al fresco 100% per 5 min.
  6. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 5 min.
  7. Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 5 min.
  8. Immergere i vetrini in acqua deionizzata per 5 min.

2. Antigen Retrieval

  1. Immergere i vetrini in tampone Tris-EDTA (pH 9,0) e riscaldare in una pentola a pressione a 125 ° C per 30 sec, quindi 90 ° C per 10 sec.
  2. Lasciare raffreddare i vetrini per 60 min.
  3. Immergere i vetrini in TBST per 5 min; rEPEal doppio.

3. Colorazione

  1. Pulire soluzioni in tutto il tessuto nelle diapositive. Segnare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofobo.
  2. Porre i vetrini in una camera umida ed evitare l'essiccamento del tessuto sul vetrino durante tutto il processo di colorazione intero. Porre una goccia (circa 200 pl o più per coprire la zona di tessuto completamente) del blocco perossidasi all'interno del cerchio idrofobico sul vetrino ed incubare i vetrini in blocco perossidasi per 5 min.
  3. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
  4. Porre una goccia di BLOCK ACE tampone di bloccaggio su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
  5. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
  6. Mettere una goccia di soluzione di avidina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
  7. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
  8. Mettere una goccia di soluzione di biotina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
  9. Risciacquare slides con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
  10. Incubare vetrini con diluizione di 1:1000 topo anti-B7-H1 anticorpo monoclonale (clone 5H1) o un mouse IgG1 κ controllo isotipico in 200 microlitri TBST a 4 ° C per una notte per 22 ore + / - 1 h. La concentrazione finale di anticorpo in TBST è 2,57 mg / ml.
  11. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
  12. Incubare vetrini con biotina coniugata ratto anti-topo IgG1 anticorpo secondario ad una concentrazione 1:500 (in 200 ul di soluzione al 2% di siero di capra) per 30 min.
  13. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
  14. Una goccia di streptavidina-biotina Complex (deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell'uso) su ciascun vetrino e incubare per 15 min.
  15. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
  16. Porre una goccia di reagente di amplificazione (diluito 2:1 con TBST) su ogni diapositiva e incubare per 4 min.
  17. Sciacquare i vetrini con TBST, quindi posto in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
  18. Porre una goccia di streptavidina-HRP in ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
  19. Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
  20. Una goccia di 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogeno su ciascun vetrino e sviluppare il colore per 2 min.
  21. Subito dopo lo sviluppo del colore, lavare i vetrini con DDH 2 O per 1-2 min.
  22. Incubare vetrini con una goccia di ematossilina per 90 sec.
  23. Lavare con DDH 2 O per 1-2 min.
  24. Lavare con acqua corrente e sapone per 1-2 min.
  25. Lavare con DDH 2 O per 1-2 min.

4. Disidratazione e montaggio

  1. Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 3 min.
  2. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 3 min.
  3. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Ripeti.
  4. Immergere i vetrini in xilene per 5 min. Ripeti.
  5. Aggiungere una goccia diCytoseal 60 a diapositiva e il luogo del coprioggetto.

La Tabella 1 elenca i reagenti utilizzati nelle procedure sopra descritte.

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Risultati

Un successo colorazione immunoistochimica di B7-H1 dimostrerà l'espressione eterogenea di B7-H1 (marrone segnali di sviluppo di colore DAB) in adenocarcinoma pancreatico. Alcune cellule pancreatiche adenocarcinoma hanno espressione prevalentemente membranosa B7-H1 (Figura 1A), mentre altri hanno espressione sia prevalentemente citoplasmatica di B7-H1 o espressione poco B7-H1 (figure 2 e 3). Epitelio dotto pancreatico normale esprime poco B7-H1 (Figura 4). Colorazion...

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Discussione

Immunoistochimica del B7-H1 sulla criosezioni è stato riportato in studi precedenti per una varietà di tumori 3,4. Tuttavia, clinici campioni tumorali di solito sono disponibili solo in forma di paraffina-incastonati blocchi. L'anticorpo monoclonale 5H1 è recentemente stato applicato con successo per la colorazione di tessuti inclusi in paraffina tumorali compresi carcinoma renale, carcinoma della cervice, carcinoma della vescica e melanoma 13-18. B7-H1 colorazione su inclusi in paraffina ...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

EB, KMB, e HX contribuiscono allo stesso modo. Questo studio è stato sostenuto dal SPORE NCI in tumori gastrointestinali P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Fondazione Lustgarten, Viragh Foundation, Investigator Award ASCO giovane, NIH CA0090701 5T32-28 Training Grant, Sol Centro pancreatico Goldman Cancer, e della Fondazione Nazionale Pancreas.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti
CSA Sistema Dako K1500 Comprende i seguenti reagenti di cui al protocollo: blocco perossidasi, streptavidina-biotina complessi, reagenti di amplificazione, streptavidina-HRP, ed il substrato cromogeno DAB e
Avidina / biotina Blocco Kit Vettore SP-2001
Blocco ACE Serotec BUF029
Biotina anti-topo IgG1 BD 553441
IgG1 di topo K Isotype controllo eBioscience 14-4714-85
TBS (Tris-salina tamponata), 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS contiene 80 g / L di NaCl e 24,2 g / L Tirs;
Diluito a 1X con ddH2O per lavaggi;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 ml aggiunto a 1 L di 1X TBS per fare TBST
Target Retrieval, 20x Celerus Onda 014-3000-000 Diluito a 1x con DDH 2 O
Alcool etilico 190 Proof Pharmco-Aaper 111000190
Alcool etilico 200 Proof PHARMO-Aaper 111000200
Xilene VWR 95057-827
Ematossilina Richard-Allan scientifico 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan scientifico 8310-4
Coprioggetto Corning 2940-245
Umidità camera Sigma H6644
Tabella 1. Reagenti e apparecchiature.

Riferimenti

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
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