Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Sommario

Il metodo Green Monster consente l'assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.

Abstract

Fenotipi di una delezione del gene sono spesso rivelati solo quando la mutazione viene testato in un contesto particolare genetica o ^1,2 condizione ambientale. Ci sono esempi in cui molti geni devono essere eliminati per smascherare le funzioni del gene nascoste ^3,4. Nonostante il potenziale di scoperte importanti, interazioni genetiche che coinvolgono tre o più geni sono in gran parte inesplorate. Ricerche esaustive di multi-mutanti interazioni sarebbe impraticabile a causa del gran numero di possibili combinazioni di delezioni. Tuttavia, studi di insiemi di geni selezionati, quali giochi di paraloghi con una maggiore possibilità di scambio priori una funzione comune, sarebbe informativo.

Nel lievito Saccharomyces cerevisiae, knockout gene è realizzato sostituendo un gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Poiché il numero di marcatori è limitata, sono stati sviluppati metodi per rimuovere e riutilizzare il sam ^5,6,7,8,9,10 e marcatore. Tuttavia, sequenzialmente mutazioni ingegneria multipli utilizzando questi metodi richiede tempo perché il tempo richiesto scale linearmente con il numero di delezioni da generare.

Qui si descrive il metodo Verde Monster per routine ingegnerizzazione molteplici delezioni nel lievito ^11. In questo metodo, una proteina verde fluorescente (GFP) reporter integrato in delezioni viene utilizzato per quantitativamente ceppi etichette secondo il numero delle delezioni contenuti in ogni ceppo (Figura 1). Cicli ripetuti di assortimento di GFP-segnate delezioni tramite accoppiamento lievito e meiosi accoppiato con citometria a flusso arricchimento di ceppi che trasportano più di queste delezioni portare all'accumulo di delezioni in ceppi (Figura 2). Esecuzione di più processi in parallelo, con ogni processo che incorpora uno o più delezioni per round, riduce il tempo richiesto per la costruzione ceppo. contenuto "> Il primo passo è quello di preparare aploidi singolo mutanti chiamato 'ProMonsters,' ciascuno dei quali porta un reporter GFP in un luogo cancellato e uno dei 'toolkit' loci-sia-una GMToolkit verde Monster o GMToolkit-α al . can1Δ locus (Figura 3) utilizzando ceppi della collezione delezione lievito ^12, GFP-marcate delezioni possono essere convenientemente generato sostituendo il comune KanMX4 cassetta esistente in questi ceppi con un universale GFP - URA3 frammento Ogni GMToolkit contiene:. sia l'una - o α-accoppiamento di tipo-specifico marcatore di selezione aploide ¹ ed esattamente uno dei due marcatori che, quando entrambi sono presenti GMToolkits, collettivamente permettere una selezione di diploidi.

Il secondo passo è quello di effettuare il ciclismo sessuale attraverso cui loci cancellare possono essere combinate in una singola cellula dal assortimento casuale e / o recomb meioticaminazione che accompagna ogni ciclo di accoppiamento e la sporulazione.

Protocollo

1. Generazione di ProMonsters

1. Preparare la cassetta universale sostituzione GFP, amplificando un tetO _2-GFP marcatore e il marcatore URA3 dal plasmide pYOGM012 (resistenza all'ampicillina) utilizzando primer con le sequenze:
   GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG e GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (regioni in grassetto fornire omologia con le regioni a fianco della cassetta KanMX4 permettendo la sostituzione mirata). La reazione PCR deve essere effettuata con Phusion polimerasi, tampone HF, e il 3% dimetilsolfo....

Risultati

Quando un ceppo aploide portare quattro eliminazioni GFP segnalati (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) è stata incrociata con un α-ceppo aploide portare quattro eliminazioni (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con due eliminazioni (ycl033cΔ yer042wΔ) condiviso da due ceppi, da un rappresentante risultato è stato ottenuto. La miscela di accoppiamento è stato coltivato in terreno contenente YPDA G418 e Nat per selezionare diploidi. Le diploidi risultanti sono state coltivat.......

Discussione

Come abbiamo sviluppato l'approccio verde mostro, eravamo preoccupati con la possibilità di ricombinazione tra i diversi cassetti di ricambio GFP, con conseguente riarrangiamento del genoma. Attenuare contro questa possibilità è la selezione per le cellule che hanno superato con successo a vari cicli di accoppiamento e meiosi. Cellule recanti genomi riarrangiati dovrebbero essere meno misura dopo l'accoppiamento di cellule senza un riarrangiamento identica. In effetti, non abbiamo osservato alcuna instabilità de.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente o strumento	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
G418	Sigma-Aldrich	A1720	Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 200 mg / ml. Conservare a 4 ° C.
ClonNAT (nourseothricin)	WERNER BioAgents	5001000	Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 100 mg / ml. Conservare a 4 ° C.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	Sciogliere in etanolo al 50% e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Foto di concentrazione: 10 mg / ml. Fai fresco ogni quattro settimane. Scudo da luce utilizzando un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C.
Zymolyase	ZymoResearch	E1005
Difco lievito di azoto di base w / o aminoacidi	BD	291940
Revolver (rotatore per tubi)	Labnet	H5600
Enduro XL Gel elettroforesi unità	Labnet	E0160
Sonifier 450	Branson	101-063-198
Microtip per Sonifier 450	Branson	101-148-062
FACSAria cella sorter	BD
MoFlo cella sorter	Beckman-Coulter
Biomek FX o robot equivalente	Beckman Coulter		Facoltativo. Per la realizzazione di PCR di genotipizzazione.