Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.
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Articolo metodologico
Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microglia sono cellule della linea mieloide che risiedono nel sistema nervoso centrale (CNS) 1. Queste cellule hanno un ruolo importante in patologie di molte malattie associate neuroinfiammatoria come la sclerosi multipla (MS) 2. Microglia nel sistema nervoso centrale di un normale esprimere macrofagi CD11b marcatore e mostrano un fenotipo di riposo da esprimere bassi livelli di marker di attivazione quali CD45. Durante gli eventi patologici del sistema nervoso centrale, microglia si attivano come determinato dal upregulation di CD45 e di altri marcatori 3. I fattori che influenzano il fenotipo e le funzioni di microglia nel sistema nervoso centrale non sono ben studiati. I microRNA (miRNA) sono una famiglia crescente di molecole conservate (circa 22 nucleotidi) che sono coinvolte in molti processi fisiologici come la crescita e la differenziazione cellulare 4 e patologie come l'infiammazione 5. MicroRNA downregulate l'espressione di geni bersaglio determinati legame sequenze complementari dimRNA ir e svolgono un ruolo importante nella attivazione di cellule immunitarie innate tra macrofagi e microglia 6 7. Al fine di indagare miRNA-mediate percorsi che definiscono la microglia fenotipo, funzione biologica, e per distinguere microglia da altri tipi di macrofagi, è importante per valutare quantitativamente l'espressione dei microRNA in particolari sottogruppi distinti del SNC residente microglia. Metodi comuni per misurare l'espressione dei miRNA nel SNC includono quantitativa PCR da intero tessuto neuronale e ibridazione in situ. Tuttavia, quantitativa PCR da omogenato tissutale intero non consente la valutazione dell'espressione di miRNA in microglia, che rappresentano solo 5-15% delle cellule del tessuto neuronale. Ibridazione in situ permette di valutare l'espressione di microRNA in specifici tipi cellulari nelle sezioni di tessuto, ma questo metodo non è del tutto quantitativa. In questo rapporto descriviamo una quantitativa e sensitive metodo per la rilevazione di miRNA dal real-time PCR in microglia isolato dal sistema nervoso centrale normali o durante neuroinfiammazione con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di sclerosi multipla. Il metodo descritto sarà utile per misurare il livello di espressione dei microRNA in cellule microgliali in CNS normali o durante neuroinfiammazione associato a varie patologie tra cui sclerosi multipla, ictus, lesioni traumatiche, morbo di Alzheimer e tumori cerebrali.
Protocollo
1. Isolamento della microglia dal CNS normali
Isolamento di microglia viene eseguita come descritto in precedenza con modifiche 3.
- Preparare strumenti per la dissezione e la perfusione: forbici, pinze, siringa da 10 ml con ago 27g, 15 ml Dounce omogeneizzatore (Teflon / vetro), nylon 40 micron filtro cellulare, il 40% e 70% soluzioni di Percoll, 1X PBS.
- Euthanize topi per asfissia rapido (privazione di ossigeno) in CO 2 fotocamera e immediatamente trasferire banco di laboratorio per le manipolazioni chirurgiche e perfusione.
- Eseguire le manipolazioni chirurgiche (forbici e pinze di util....
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Discussione
Recentemente notevole interesse è stato dato a microglia e il coinvolgimento di queste cellule in molte patologie associate neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Inoltre, il ruolo dei microRNA nella differenziazione delle cellule immunitarie e cancro è drammaticamente cresciuta negli ultimi anni diversi 5,10. Abbiamo precedentemente riportato il ruolo di miR-124 nel mantenimento del fenotipo non attivata o di riposo della microglia nel CNS normali 7, ma il ruolo degli altri tipi di microRNA nel .......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato dal NIH R01 NS071039-01A1 assegno di ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| PBS 1X | GIBCO | 14190 | Può essere preparati da componenti secchi nel pH laboratorio,: 7,2-7,4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Può essere preparati da componenti secchi nel pH laboratorio,: 7,2-7,4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965, 10438 | |
| Mirvana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml di Percoll 100% viene preparato miscelando 10 ml di PBS 10X e 90 ml di Percoll da Sigma. 50 ml di Percoll 70% èpreparata miscelando di 35 ml di Percoll al 100% e 15 ml di DMEM 50 ml di Percoll 40% viene preparata miscelando 20 ml di Percoll al 100% e 30 ml di 1X PBS |
| MOG 35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Tossina della pertosse | Sigma | P7208 | |
| FcR bloccando gli anticorpi | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b - PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Può essere utilizzato con fluorofori differenti (es. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs | Biolegend | 103116 | Può essere utilizzato con fluorofori differenti (ad es APC) |
| Paraformalformaldeide (16%) | EMS Inc | 15710 | Diluire 1:15 in PBS 1X |
| 15% Urea TBE-Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| Saggi TaqMan MicroRNA mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| Saggi TaqMan MicroRNA snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Acqua priva di nucleasi | Life Technologies Inc | AM9937 | Acqua priva di nucleasi |
| 384 pozzetti di reazione chiara ottica | Life Technologies Inc. | 4309849 | Possono essere sostituiti con altri (ad esempio piastre da 96 pozzetti) in tempo reale diversi strumenti PCR |
| Omogeneizzatore Dounce (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon / vetro |
| 40 μ nylon filtro cella | Falco | 352340 | |
| Centrifuga Big | Sorval | RT 6000B | Diametro rotore 18,5 centimetri |
| Centrifuga Piccolo | Eppendorf | 5415 R | Diametro rotore 6,5 centimetri |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Possono essere sostituiti con altri strumenti |
| Citometro a flusso | BD Biosciencess | LSR II | Possono essere sostituiti con altri strumenti |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Possono essere sostituiti con altri strumenti |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 |
Riferimenti
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Ristampe e permessi
