Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Sommario

Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

Abstract

Motilità cellulare è un processo biologico importante per entrambi gli organismi unicellulari e pluricellulari. È essenziale per il movimento di organismi unicellulari verso una fonte di nutrienti o lontano da condizioni inadatte, nonché negli organismi multicellulari per lo sviluppo del tessuto, sorveglianza immunitaria e guarigione delle ferite, solo per citarne alcuni ruoli ^1,2,3. La deregolamentazione di questo processo può portare a gravi malattie neurologiche, cardiovascolari e immunologiche, così come aggravato la formazione di tumori e diffondere ^4,5. Molecolarmente, polimerizzazione di actina e riciclaggio recettore hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella creazione di estensioni cellulari (lamellipodia), che guidano il movimento in avanti della cella ^6,7,8. Tuttavia, molte domande circa la migrazione delle cellule biologiche rimangono senza risposta.

Il ruolo centrale per la motilità cellulare in salute e malattia sottolinea l'importanza di comprendere il mec specificohanisms coinvolti in questo processo e rende metodi accurati per valutare la motilità cellulare particolarmente importante. Microscopi sono di solito utilizzati per visualizzare il movimento delle cellule. Tuttavia, le cellule muovono piuttosto lentamente, rendendo la misurazione quantitativa della migrazione delle cellule un processo di consumo di risorse che richiedono costose telecamere e software per creare quantitativi e ritardi film di cellule mobili. Pertanto, la capacità di eseguire una misurazione quantitativa della migrazione cellulare che è conveniente, non laborioso, e che utilizza attrezzature comuni laboratorio è una grande necessità di molti ricercatori.

Il dosaggio phagokinetic motilità traccia utilizza la capacità di una cellula in movimento per eliminare particelle d'oro dal suo percorso per creare una traccia misurabile su una colloidale oro rivestite coprioggetto ^9,10. Con l'uso di software liberamente disponibile, tracce multiple possono essere valutati per ogni trattamento di compiere esigenze statistiche. Il saggio può essere utilizzato per valutaremotilità di molti tipi di cellule, come le cellule tumorali ^11,12, fibroblasti ^{9 13,} neutrofili, cellule muscolari scheletriche, cheratinociti ^{14 15, 16} trofoblasto, cellule endoteliali e monociti ^{17, 10,18-22.} Il protocollo prevede la creazione di vetrini rivestiti con nanoparticelle di oro (Au °) che sono generati da una riduzione di acido chloroauric (Au ^{3 +)} con citrato di sodio. Questo metodo è stato sviluppato da Turkevich et al. Nel 1951 ²³ e poi migliorata nel 1970 da Frens et al. ^24,25. Come risultato di questa fase la riduzione chimica, particelle di oro (10-20 nm di diametro) precipitare dalla miscela di reazione e può essere applicato a vetrini, che sono quindi pronto per l'uso nelle analisi migrazione cellulare ^9,26,27.

In generale, il dosaggio phagokinetic motilità traccia è una misura veloce, facile e quantitativa della motilità cellulare. Inoltre,può essere utilizzato come un semplice saggio ad alta prestazione, per l'uso con i tipi di cellule che non sono suscettibili di e ritardi imaging, nonché altri usi a seconda delle esigenze del ricercatore. Insieme, la capacità di misurare quantitativamente la motilità cellulare di tipi di cellule senza la necessità di costosi microscopi e software, insieme con l'uso di attrezzature di laboratorio e prodotti chimici comuni, rendono il phagokinetic motilità saggio traccia una scelta solida per gli scienziati con un interesse a comprendere cellulare motilità.

Protocollo

1. Preparazione di gelatina rivestite coprioggetto

1. Posto lavata con acido coprioggetto (15 mm di diametro) in un piatto di plastica sterile 100 mm (es). Mettere 8-9 coprioggetti per piatto e fare in modo che non si tocchino tra loro o ai lati del piatto ..

Nota: Coprivetrini, aghi e pinzette devono essere sterili per eliminare eventuali microrganismi contaminanti, nonché endotossine che influenzano le funzioni cellulari, compresa la motilità.

2. Pesare la polvere di gelatina e risospendere la polvere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione di gelatina con una concentrazione finale di 0,5 g/300 ml. Successivamente, la soluzione di gelatina deve essere sterilizzato.
3. Dispensare 2-3 gocce di gelatina (~ 100-150 ml) su ogni vetrino coprioggetto.

Nota: Fare attenzione a non permettere la gelatina di toccare il piatto, altrimenti non sarà in grado di rimuovere i coprioggetti dal piatto.

4. Cuocere la gelatina rivestite coprioggetto nel piatto 100 millimetri in un forno a 90 ° C per 10 min.
5. Togliere l'eccesso di gelatina da pipettaggio gentile.
6. Essiccare i vetrini nel piatto 100 mm nel forno a 70 ° C per 45 min.
7. Una volta asciutto, rimuovere i coprioggetti dai piatto 100 millimetri con un ago sterile, privo di endotossine ago e pinzette (l'ago viene utilizzato per spingere delicatamente il coprioggetto per renderla accessibile per le pinzette per rimuovere delicatamente).
8. Posizionare i singoli gelatina rivestite coprioggetto in pozzetti separati di un 24-ben piatto.

2. Preparazione di oro colloidali rivestite coprioggetto

1. Pesare una quantità appropriata di acido chloroauric (triidrato tetrachloroauric acido; HAuCl ₄ · 3H ₂ O) e poi risospendere in acqua deionizzata sterile per preparare una soluzione finale di 14,5 mM (tossico). Preparare 1,5 ml di soluzione per 8-9 coprioggetti.

Attenzione: acido chloroauric è hbracciata se ingerito, provoca ustioni della pelle e gravi lesioni oculari e può causare una reazione allergica cutanea. Tossico se ingerito.

2. Pesare una quantità appropriata di citrato di sodio (trisodio diidrato 2-idrossipropano-1 ,2,3-tricarboxylate; Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ e poi risospendere la polvere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione finale di 0,5%. Preparare 1 ml di soluzione per 8-9 coprioggetti.

Attenzione: citrato di sodio può causare irritazione agli occhi e della pelle. Si può anche causare irritazione delle vie respiratorie e digestive.

3. In una sterile, privo di endotossine becher combinano 1,5 ml di sterile 14.5 mm HAuCl soluzione ₄ e 13.5 ml di acqua deionizzata sterile, il risultato dovrebbe produrre una soluzione debole giallo. I volumi di cui sopra consentiranno per 8-9 vetrini oro colloidale da effettuare.
4. Mentre continua agitazione, riscaldare la soluzione su una piastra calda finché inizia a bolio.

Attenzione: Il riscaldamento della soluzione deve essere eseguita sotto cappa, come vapori possono essere nocivi e / o tossici. I vapori sono lacerazioni del tessuto delle mucose e delle vie respiratorie superiori.

5. Togliere il becher dalla piastra.
6. In agitazione, aggiungere 0,7 ml della soluzione di citrato di sodio allo 0,5%. Il citato volume consentirà per 8-9 coprioggetti oro colloidale da effettuare.
7. Continuate a mescolare questa soluzione combinata per circa 2 min (Nota: il colore della soluzione cambierà gradualmente dal giallo tenue, per cancellare, al grigio, al viola, al viola intenso, prima di raggiungere un vino rosso o, preferibilmente, di colore ruggine) . Questo prodotto è la soluzione oro colloidale.
8. Raffreddare la soluzione di oro colloidale in una pipetta 10 ml per 1-2 min (per mantenere il livello gelatina sul coprioggetto da fusione quando la soluzione viene aggiunta oro colloidale) e poi aggiungere 1,0-2,0 ml del colloidal oro su ogni soluzione di gelatina rivestite coprioggetto precedentemente posto in un piatto da 24 pozzetti (es) (la quantità della soluzione oro colloidale che si aggiungono ai gelatina rivestite coprioggetto dipende da come le particelle d'oro precipitato nella soluzione - vedi commenti qui sotto).

Nota: Perché ci possono essere variazioni in termini di efficienza di precipitazione delle particelle d'oro, si consiglia di aggiungere prima 0,5-1 ml della soluzione di oro colloidale ai gelatina rivestite coprioggetto e quindi posizionare il piatto da 24 pozzetti in incubatrice per 0,5 ore . Dopo questo periodo di incubazione, i coprioggetti devono essere controllati al microscopio ottico per la appropriata densità delle particelle d'oro sui coprioggetti. Vedere Figura 1 per 20x immagini al microscopio di esempi di troppo bassa e troppo alta concentrazione di particelle d'oro. Vedere Figura 2 per immagini al microscopio 40x di una concentrazione ideale di particelle d'oro (almeno per l'uso con monociti). L'optdensità imal delle nanoparticelle di oro sul vetrino deve essere determinato sperimentalmente per ogni tipo cellulare utilizzato, come le caratteristiche delle diverse cellule detterà loro forza di movimento sui vetrini. Se la concentrazione di particelle d'oro è insufficiente, aggiungere un ulteriore 0,5-1 ml della soluzione di oro colloidale alla gelatina rivestite coprioggetto.

A seconda della dimensione della cella, la concentrazione appropriata delle particelle d'oro può variare e, quindi, in ultima analisi dipende dalle dimensioni della cella esaminato per motilità. Per esempio, con monociti umani in piccole celle di dimensione (~ 10-20 um ^28), una maggiore concentrazione di particelle d'oro è stato richiesto nelle nostre analisi. La distribuzione appropriata di nanoparticelle di oro fornisce il ricercatore con la capacità di distinguere facilmente ed efficientemente i bordi delle tracce cellulari. Una concentrazione di particelle d'oro che è troppo alto ostacola la capacità delle cellule di muoversi e quindi di misurare accuratamenteloro motilità, mentre una concentrazione di particelle d'oro che è troppo bassa limita la capacità di delineare quelli una traccia precisa della motilità.

Nota importante: se la sintesi di nanoparticelle di oro è problematico, nanoparticelle d'oro sintetizzati sono disponibili in commercio nei formati da 5 nm a 400 nm. Inoltre, microsfere fluorescenti sono state utilizzate in studi di motilità cellulare ^29. Tuttavia, l'uso di queste microsfere richiede un microscopio fluorescente per l'analisi della migrazione cellulare.

9. Posizionare il 24 pozzetti piatto con oro colloidale ricoperte di vetrini in un incubatore a 37 ° C ed incubare da 1 ora a tutta la notte.
10. Dopo l'incubazione, lavare / rimuovere oro non legato immergendo i coprioggetti (3x) in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS, pH 7,4).
11. Posizionare questi colloidali d'oro rivestite coprioggetto in un ambiente pulito 12 e piatto (i) contenente PBS.
12. Conservare queste coprioggetti a 4 ° C fino al momentoutilizzare (parafilm la piastra prima di mettere in frigorifero).

Nota importante: Tenere sempre le colloidali d'oro rivestite coprioggetto in qualche tipo di liquido / media come le particelle d'oro possono sfaldarsi dalle coprioggetti se lasciati asciugare. I coprioggetti oro colloidale deve essere utilizzato entro 2-3 mesi dalla data in cui sono state formulate.

Controllo qualità: In un singolo saggio phagokinetic motilità pista, è fondamentale utilizzare coprioggetti caratterizzati da una concentrazione simile di particelle d'oro. Questo punto semplice consentirà le differenze quantitative motilità cellulare tra campioni di essere unicamente a causa della natura del trattamento e non le proprietà fisiche dei colloidali oro rivestite coprioggetto. Favoriamo con coprioggetto solo fatte al tempo stesso in singoli esperimenti, sebbene abbiamo dimostrato che finché la densità delle nanoparticelle di oro sono uguali, l'uso di coprioggettoda diverse preparazioni è appropriato.

3. Analisi della motilità cellulare

1. Posizionare i colloidali d'oro rivestite coprioggetto in un supporto appropriato cellulari per le celle di interesse.
2. Trasferire le cellule opportunamente trattate sulle colloidali d'oro rivestite coprioggetto posti in un piatto da 24 pozzetti (es)

Nota: Il numero di celle trasferite al singolo pozzo deve essere determinato per ciascun tipo di cella studiata. Idealmente, le cellule devono essere distribuiti sulla colloidale oro rivestite coprioggetto, che a sua volta consente per l'analisi statistica delle tracce solo creati da una singola cella. Se le cellule vengono piastrate ad una concentrazione troppo alta, diventa altamente probabile che tracce sovrapposizione di più celle si vedrà. Tracce sovrapposte non può essere quantificato con precisione e, quindi, non possono essere prese in considerazione nelle analisi finali del movimento delle cellule testate. Sovrapposizione tracce come risultato diil coinvolgimento di più celle sono di solito facilmente osservare, come fusi o incrociate brani (nel campo di analisi) in cui due o più celle possono essere osservati nella stessa area contigua cancellata.

3. Incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ per 24 ore (o per qualsiasi momento adatto, ad esempio, abbiamo analizzato la motilità dei monociti tra 6 ore e 24 ore le cellule post-trattamento ed endoteliali a 12 ore dopo il trattamento). La tempistica ottimale per determinare e misurare la motilità cellulare varierà con il tipo di cella studiata e, quindi deve essere determinato sperimentalmente per ogni tipo cellulare (un buon punto di partenza, tuttavia, è 6-12 ore dopo il trattamento).

Nota: Se sperimentali oro colloidali rivestite coprioggetto devono essere immagazzinati e / o analizzati in un secondo tempo, le cellule e nanoparticelle d'oro devono essere fissati sui vetrini. Per compiere questo passo fissazione; seguente Passaggio 3.3, primo lavaggio coprioggetti accuratamente 2 volte con 1xPBS (immersione del coprioggetti è preferibile, come la rimozione di nanoparticelle di oro da coprioggetto deve essere evitata), quindi utilizzare un metodo standard di fissazione delle cellule, quali incubazione a temperatura ambiente con paraformaldeide al 3%. Dopo 15 min di incubazione, la paraformaldeide 3% deve essere rimosso e lavato con cura i coprioggetti 3 volte con PBS 1x. I coprioggetti fissi possono essere conservati in frigorifero.

4. Utilizzando un microscopio ottico, catturare immagini delle tracce create da una singola cellula in movimento (Nota: L'ingrandimento utilizzato per fotografare tracce cellulari certamente variare a seconda del tipo di cellula in esame). Esempi di tracce cellulari creati da cellule non mobili e mobili su oro colloidale rivestite coprioggetto sono mostrati nella Figura 2.

Nota: Le nanoparticelle di oro del formato usato nel saggio phagokinetic motilità traccia è stato trovato per essere completamente non tossico per le cellule ^30. Se necessario, La vitalità delle cellule esaminate può essere valutata mediante colorazione con tripan blu o esaminati per altri marcatori di vitalità cellulare. Si dovrebbe tener conto della necessità di fissaggio, tipo di fissaggio, ecc, se questa fase deve essere intrapreso.

5. Utilizzando il software liberamente disponibile, come software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), sia sviluppato al National Institutes of Health, o ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ), sviluppato presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio, la superficie media (in unità arbitrarie) di oro colloidale autorizzata dalla 10-20 o più celle (per campione) viene determinata per ciascun braccio sperimentale dalle immagini catturate. Le statistiche possono quindi essere eseguito su tha raccolto i risultati. Ad esempio, i risultati possono essere rappresentati come media ± l'errore standard dei mezzi (SEM) con test t di Student eseguiti, e un valore di p <0.05 utilizzati come misura di significatività statistica tra i campioni. Figure 3 e 4 passaggi mostrano nel analisi dell'area di oro colloidale eliminato dalla cellula.

Risultati

Viene mostrato un esempio di immagini prese al microscopio ottico mostra un'area traccia cancellata da una singola cellula (un monocita dai nostri esperimenti è mostrato in Figura 2). Non mobili cellule creano caratteristica piccola, ovale o di forma circolare intorno si tratti indicanti un basso livello basale di movimento per queste cellule non stimolate (Figure 2A e 2B). In contrasto, cellule altamente motili [nel nostro sistema, citomegalovirus umano (HCMV) cellule infettate] sono c...

Discussione

Il saggio di motilità phagokinetic brano presentato in questo articolo è un metodo semplice e molto efficace per l'analisi quantitativa della migrazione cellulare. Perché più tipi di cellule possono essere analizzati ^9-17, questo metodo ha il potenziale utilizzo ampio diverse discipline. L'uso di oro colloidale rivestite coprioggetto consente la misurazione di una zona traccia cancellata da una cellula in movimento. Il dosaggio può misurare l'effetto di stimoli differenti fattori di crescita (...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coprioggetto di vetro (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gelatina 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Acid triidrato Tetrachloroauric	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (una soluzione di lavorazione finale)
Citrato di sodio	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (soluzione di lavoro finale)
Paraformaldeide	Fisher Scientific	O4042	3% (una soluzione di lavorazione finale)
100 millimetri tessuto piatto Cultura	Sarstedt	83,1802
12-pozzetti	Fisher Scientific	08-772-29
Piastre da 24 pozzetti	Fisher Scientific	07-200-84
Techne Forno Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	Il forno di laboratorio standard sarà sufficiente
10 ml Pipette sierologiche	Sarstedt	86.1254.001
Pipettare-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 singolo manuale dei canali Pipette	Rainin	PR-200
200 ml Barrier Tips	CLP	BT200
ImageJ software	http :/ / rsb.info.nih.gov / IJ /		Licenza: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotometrici in bianco e nero a 12 bit CCD	Nikon		Fuori, La specifica più simile ha Nikon Eclipse Ti, ma una estremità inferiore Nikon 80i sarà adatto pure. Altri marchi forniscono anche microscopi comparabili.
			Nota: I reagenti e le attrezzature elencati di seguito sono stati utilizzati da noi nei nostri studi diversi. Altri materiali di consumo, fornitori, reagenti e le apparecchiature possono essere utilizzati, purché abbiano specifiche simili.