Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Motilità cellulare è un processo biologico importante per entrambi gli organismi unicellulari e pluricellulari. È essenziale per il movimento di organismi unicellulari verso una fonte di nutrienti o lontano da condizioni inadatte, nonché negli organismi multicellulari per lo sviluppo del tessuto, sorveglianza immunitaria e guarigione delle ferite, solo per citarne alcuni ruoli 1,2,3. La deregolamentazione di questo processo può portare a gravi malattie neurologiche, cardiovascolari e immunologiche, così come aggravato la formazione di tumori e diffondere 4,5. Molecolarmente, polimerizzazione di actina e riciclaggio recettore hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella creazione di estensioni cellulari (lamellipodia), che guidano il movimento in avanti della cella 6,7,8. Tuttavia, molte domande circa la migrazione delle cellule biologiche rimangono senza risposta.
Il ruolo centrale per la motilità cellulare in salute e malattia sottolinea l'importanza di comprendere il mec specificohanisms coinvolti in questo processo e rende metodi accurati per valutare la motilità cellulare particolarmente importante. Microscopi sono di solito utilizzati per visualizzare il movimento delle cellule. Tuttavia, le cellule muovono piuttosto lentamente, rendendo la misurazione quantitativa della migrazione delle cellule un processo di consumo di risorse che richiedono costose telecamere e software per creare quantitativi e ritardi film di cellule mobili. Pertanto, la capacità di eseguire una misurazione quantitativa della migrazione cellulare che è conveniente, non laborioso, e che utilizza attrezzature comuni laboratorio è una grande necessità di molti ricercatori.
Il dosaggio phagokinetic motilità traccia utilizza la capacità di una cellula in movimento per eliminare particelle d'oro dal suo percorso per creare una traccia misurabile su una colloidale oro rivestite coprioggetto 9,10. Con l'uso di software liberamente disponibile, tracce multiple possono essere valutati per ogni trattamento di compiere esigenze statistiche. Il saggio può essere utilizzato per valutaremotilità di molti tipi di cellule, come le cellule tumorali 11,12, fibroblasti 9 13, neutrofili, cellule muscolari scheletriche, cheratinociti 14 15, 16 trofoblasto, cellule endoteliali e monociti 17, 10,18-22. Il protocollo prevede la creazione di vetrini rivestiti con nanoparticelle di oro (Au °) che sono generati da una riduzione di acido chloroauric (Au 3 +) con citrato di sodio. Questo metodo è stato sviluppato da Turkevich et al. Nel 1951 23 e poi migliorata nel 1970 da Frens et al. 24,25. Come risultato di questa fase la riduzione chimica, particelle di oro (10-20 nm di diametro) precipitare dalla miscela di reazione e può essere applicato a vetrini, che sono quindi pronto per l'uso nelle analisi migrazione cellulare 9,26,27.
In generale, il dosaggio phagokinetic motilità traccia è una misura veloce, facile e quantitativa della motilità cellulare. Inoltre,può essere utilizzato come un semplice saggio ad alta prestazione, per l'uso con i tipi di cellule che non sono suscettibili di e ritardi imaging, nonché altri usi a seconda delle esigenze del ricercatore. Insieme, la capacità di misurare quantitativamente la motilità cellulare di tipi di cellule senza la necessità di costosi microscopi e software, insieme con l'uso di attrezzature di laboratorio e prodotti chimici comuni, rendono il phagokinetic motilità saggio traccia una scelta solida per gli scienziati con un interesse a comprendere cellulare motilità.
Protocollo
1. Preparazione di gelatina rivestite coprioggetto
- Posto lavata con acido coprioggetto (15 mm di diametro) in un piatto di plastica sterile 100 mm (es). Mettere 8-9 coprioggetti per piatto e fare in modo che non si tocchino tra loro o ai lati del piatto ..
Nota: Coprivetrini, aghi e pinzette devono essere sterili per eliminare eventuali microrganismi contaminanti, nonché endotossine che influenzano le funzioni cellulari, compresa la motilità.
- Pesare la polvere di gelatina e risospendere la polvere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione di gelatina con una concentrazione fin....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Viene mostrato un esempio di immagini prese al microscopio ottico mostra un'area traccia cancellata da una singola cellula (un monocita dai nostri esperimenti è mostrato in Figura 2). Non mobili cellule creano caratteristica piccola, ovale o di forma circolare intorno si tratti indicanti un basso livello basale di movimento per queste cellule non stimolate (Figure 2A e 2B). In contrasto, cellule altamente motili [nel nostro sistema, citomegalovirus umano (HCMV) cellule infettate] so.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il saggio di motilità phagokinetic brano presentato in questo articolo è un metodo semplice e molto efficace per l'analisi quantitativa della migrazione cellulare. Perché più tipi di cellule possono essere analizzati 9-17, questo metodo ha il potenziale utilizzo ampio diverse discipline. L'uso di oro colloidale rivestite coprioggetto consente la misurazione di una zona traccia cancellata da una cellula in movimento. Il dosaggio può misurare l'effetto di stimoli differenti fattori di crescita (.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, e GM103433), un Malcolm Feist cardiovascolare ricerca borsa di studio, e un americano comunione Heart Association predoctoral (10PRE4200007).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Coprioggetto di vetro (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatina 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Acid triidrato Tetrachloroauric | Fisher Chemical | G54-1 | 14,5 mM (una soluzione di lavorazione finale) |
| Citrato di sodio | Fisher Scientific | BP327-500 | 0,5% (soluzione di lavoro finale) |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | O4042 | 3% (una soluzione di lavorazione finale) |
| 100 millimetri tessuto piatto Cultura | Sarstedt | 83,1802 | |
| 12-pozzetti | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Piastre da 24 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Forno Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | Il forno di laboratorio standard sarà sufficiente |
| 10 ml Pipette sierologiche | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettare-Aid Filler / Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 singolo manuale dei canali Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http :/ / rsb.info.nih.gov / IJ / | Licenza: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotometrici in bianco e nero a 12 bit CCD | Nikon | Fuori, La specifica più simile ha Nikon Eclipse Ti, ma una estremità inferiore Nikon 80i sarà adatto pure. Altri marchi forniscono anche microscopi comparabili. | |
| Nota: I reagenti e le attrezzature elencati di seguito sono stati utilizzati da noi nei nostri studi diversi. Altri materiali di consumo, fornitori, reagenti e le apparecchiature possono essere utilizzati, purché abbiano specifiche simili. |
Riferimenti
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
