La generazione e la caratterizzazione di cellule T specifiche tumorali usando topi umanizzati è descritto qui. Umana tessuto timico e geneticamente modificate cellule staminali ematopoietiche vengono trapiantate in topi immunocompromessi. Ciò comporta la ricostituzione di un ingegnerizzato sistema immunitario umano consentendo in esame vivo delle risposte immunitarie anti-tumorali.
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Articolo metodologico
Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modelli animali di piccola taglia come i topi sono stati ampiamente utilizzati per studiare le malattie umane e per sviluppare nuovi interventi terapeutici. Nonostante la ricchezza di informazioni ottenute da questi studi, le caratteristiche uniche di immunità mouse nonché la specificità di specie di malattie virali come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) ha portato allo sviluppo di modelli murini umanizzati. I modelli precedenti ha comportato l'utilizzo di C. B 17 scid / scid topo e il trapianto di timo fetale umano e nel fegato fetale chiamati tua / liv (SCID-hu) 1, 2 o il trasferimento adottivo di umani leucociti del sangue periferico (SCID-huPBL ) 3. Entrambi i modelli sono stati utilizzati principalmente per lo studio dell'infezione da HIV.
Uno dei limiti principali di entrambi questi modelli era la mancanza di ricostituzione stabile di cellule immunitarie nella periferia di renderli un modello più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia da HIV. A tal fine, il ronzio BLTmodello murino anized è stato sviluppato. BLT è l'acronimo di midollo osseo / fegato / timo. In questo modello, da 6 a 8 settimane di età NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) topi immunocompromessi ricevere il tuo / liv impianto come nella SCID-hu modello di topo solo per essere seguita da un secondo trapianto di cellule staminali ematopoietiche umane 4. Il vantaggio di questo sistema è la piena ricostituzione del sistema immunitario umano in periferia. Questo modello è stato utilizzato per studiare l'infezione da HIV e latenza 5-8.
Abbiamo generato una versione modificata di questo modello, in cui usiamo geneticamente modificato cellule staminali ematopoietiche (HHSC) per costruire la tua / liv impianto seguita da iniezione di trasdotte autologo HHSC 7, 9. Questo approccio si traduce nella generazione di lignaggi geneticamente modificati. Ancora più importante, abbiamo adattato questo sistema per esaminare il potenziale di generare funzionali cellule T citotossici (CTL) che esprime uno specifico recettore di cellula T melanoma. Utilizzando questo modello siamo stati in grado di valutare la funzionalità del nostro CTL transgenico vivo utilizzando la tomografia ad emissione di positroni (PET) per determinare regressione tumorale (9).
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere il processo di generazione di questi topi transgenici e di valutare l'efficacia in vivo utilizzando l'imaging dal vivo PET. Come nota, dato che usiamo tessuti umani e vettori lentivirali, i nostri impianti sono conformi alle linee guida CDC NIH per livello di biosicurezza 2 (BSL2) con precauzioni speciali (BSL2 +). Inoltre, i topi del GFN sono gravemente immunocompromessi in tal modo, la loro custodia e la manutenzione devono essere conformi ai più elevati standard di salute ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocollo
A. Generazione di topi BLT
La generazione di topi BLT è diviso in tre (3) parti: (1) di trattamento di tessuto fetale e la preparazione di cellule CD34 staminali ematopoietiche, (2) i trapianti di tessuto umano, e (3) trapianto secondario. Per tutti i protocolli, abbiamo fornito Tabella 1 con informazioni reagente.
1. Tissue Processing e l'isolamento di CD34 cellule staminali ematopoietiche
Fresco tessuto fetale o tessuto PREZZO sul ghiaccio da varie agenzie di approvvigionamento di organi può essere utilizzato. Spesso tessuto fetale non è sterile, come dimostra la ....
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Risultati
Un diagramma di flusso del processo di trapianto è mostrato nella Figura 1A. Una foto del tuo / liv impianto è mostrato in Figura 1B. Il tessuto timico sviluppa normalmente e ha una distribuzione fisiologica di CD4 umano e cellule T CD8. Dopo ricostituzione, gli animali portano un sistema immunitario umano con distribuzione normale di CD4, CD8 T e altre linee cellulari immunitarie.
La discrepanza tra dimensione del tumore e tessuto vivo è mostrato in
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Discussione
La modifica modello di topo umanizzato BLT accoppiato con PET in vivo imaging sono potenti strumenti per studiare malattie croniche umane. Questo sistema prende il modello BLT del mouse e sposta in avanti di là della portata limitata per la ricerca sull'HIV. Inoltre, è un grande sistema in cui possiamo esaminare vari protocolli di terapia genica e le tecniche diagnostiche prima di poter raggiungere l'impostazione clinica. Quest'ultimo accoppiato con il basso costo di utilizzo di topi contro primati .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Alvin Welch e Larry Pang per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institutes of Health (NIH) di aggiudicazione P50 CA086306, il California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sovvenzioni RC1-00149-1 e RS1-00203-1; CIRM Premio Nuova Facoltà RN2-00902-1 , il Caltech-UCLA Centro comune Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, la UCLA AIDS Institute, gli Strumenti CIRM e Technology Award RT1-01126, e il Programma Multicampus UC ricerca e le iniziative della California Center for Drug Discovery antivirale (numero MRPI-143226).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenasi di tipo IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Ialuronidasi | H3506 | ||
| DNAsi I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillina / tazobactam combinazione | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | Vedere i commenti | MACS buffer: PBS integrato con 0,5% di siero fetale bovino e 2 mM citrato destrosio formula-A |
| CD34 microsfere Kit | 130-046-702 | ||
| LS Colonne | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorano | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
Riferimenti
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A.
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Ristampe e permessi
