High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Summary

Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l'attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.

Abstract

Membri specifici della famiglia verso l'interno canale del potassio raddrizzatore (Kir) sono postulato bersagli farmacologici per una varietà di disturbi, tra cui l'ipertensione, fibrillazione atriale, e ^1,2 dolore. Per la maggior parte, tuttavia, i progressi verso la comprensione il loro potenziale terapeutico o funzioni fisiologiche anche di base è stata rallentata dalla mancanza di buoni strumenti farmacologici. In effetti, la farmacologia molecolare della famiglia raddrizzatore verso l'interno è rimasta molto indietro quella della superfamiglia S4 del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canali, per i quali un certo numero di nanomolare affinità e altamente modulatori selettivi tossine peptidi sono stati scoperti ^3. Il tertiapin veleno d'api tossina e suoi derivati ​​sono potenti inibitori del Kir1.1 e Kir3 canali ^4,5, ma peptidi sono di uso limitato terapeuticamente nonché sperimentalmente a causa delle loro proprietà antigeniche e scarsa biodisponibilità, stabilità metabolica e penetranza tessuto. Lo sviluppo di potentie selettivi piccole molecole sonde con migliori proprietà farmacologiche sarà una chiave per comprendere appieno la fisiologia e la potenziale terapeutico dei canali Kir.

La molecolare Biblioteche Sonde Produzione Centro connessioni di rete (MLPCN) supportato dal National Institutes of Health (NIH) Fondo comune ha creato opportunità per gli scienziati accademici di avviare campagne di sonda di rilevamento per target molecolari e vie di segnalazione che hanno bisogno di una migliore farmacologia ^6. Il MLPCN fornisce ai ricercatori l'accesso per l'industria scala centri di screening e chimica farmaceutica e informatica sostegno per sviluppare piccole molecole sonde di chiarire la funzione dei geni e delle reti di geni. La fase critica l'ammissione al MLPCN è lo sviluppo di un saggio robusto bersaglio o percorso specifico che è suscettibile di screening ad alto rendimento (HTS).

Qui, descriviamo come sviluppare una fluorescenza a base di tallio (Tl ⁺⁾ flusso assay della funzione Kir canale per screening ad alto rendimento composto ^7,8,9,10. Il saggio è basato sulla permeabilità del poro K ⁺ canale al K ⁺ congenere Tl ^+. A disponibile in commercio fluorescente Tl ⁺ colorante reporter viene utilizzato per rilevare il flusso transmembrana di Tl ⁺ attraverso il poro. Ci sono almeno tre coloranti disponibili in commercio che sono adatti per TL ⁺ saggi flusso: BTC, FluoZin-2, ^7,8 e FluxOR. Questo protocollo descrive lo sviluppo dosaggio con FluoZin-2. Anche se originariamente sviluppati e commercializzati come un indicatore di zinco, FluoZin-2 presenta un incremento robusto e dose-dipendente in emissione di fluorescenza su Tl ⁺ vincolante. Abbiamo iniziato a lavorare con FluoZin-2 prima FluxOR era disponibile ^7,8 e hanno continuato a farlo ^9,10. Tuttavia, le fasi di sviluppo del test sono sostanzialmente identiche per tutti e tre i coloranti, e gli utenti devono determinare quale colorante è più adatto per la loro specifica nresponsabili politici. Discutiamo anche benchmark delle prestazioni del saggio che devono essere raggiunti da considerare per l'ingresso al MLPCN. Poiché Tl ⁺ permea facilmente la maggior parte dei canali del K ^+, il test deve essere adattabile alla maggior parte dei canali K ⁺ obiettivi.

Protocol

1. Generazione di linee cellulari stabili policlonali

1. La creazione di una linea di cellule di alta qualità stabile che esprime il canale Kir di interesse è un primo passo importante verso lo sviluppo di una robusta high-throughput test di screening. Sovraespressione costitutiva K ⁺ canale può portare alla attivazione di vie di morte cellulare, stabile degenerazione linea cellulare e la perdita di prestazioni del dosaggio. Per evitare questi potenziali problemi e fornire un comodo controllo interno di sviluppo dosaggio (vedere sotto), una tetraciclina inducibile sistema di espressione è consigliato ^8.
2. Cultura parentale T-REX-....

Results

L'uso di una tetraciclina inducibile sistema di espressione fornisce un comodo controllo interno per distinguere Tl ⁺ flusso attraverso percorsi endogeni e il canale Kir di interesse. Figura 1 mostra alcuni esempi di mappe di placcatura cellulari utilizzate in diversi tipi di esperimenti. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule uninduced o tetraciclina indotta sono indicati con colori diversi. Figura 2A mostra la mappa piastra sorgente utilizzato per determinare la conce.......

Discussion

Trattamento: Una volta che i dati sono raccolti, un passo comune consiste nell'analisi normalizzare risposta di fluorescenza di ciascun pozzetto, F, al suo valore iniziale all'inizio dell'esperimento, F _0. Questo è comunemente indicato come "rapporto statico" e simboleggiato "F / F ^_0". Nei casi in cui è dominato F ₀ dal colorante indicatore dell'operazione rapporto statico sarà sostanzialmente per correggere molti fattori qu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetraciclina-inducibile vettore di espressione
T-REX-cellule HEK293	Invitrogen	R71007	Tetraciclina-inducibile linea cellulare
Lipofectamine LTX / Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagente
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cella cultura dei media
DMEM	Invitrogen	11965	Cella cultura dei media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cella cultura dei media
Blasticidina S	Invitrogen	R210-01	Cella cultura dei media
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15140	Cella cultura dei media
HBSS-bivalente libero	Mediatech	21022CV	Cella di lavaggio
Tripsina 0,25%	Mediatech	25053CI	Dissociazione cellulare
Tetraciclina-HCl	Sigma	T9823	Induzione reagente
Dializzato FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Placcatura dei media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Colorante fluorescente
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye carico
HBSS	Invitrogen	14175	Assay Buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay Buffer
NaHCO 3	Sigma	S6297	Tl + stimolo tampone
MgSO4	Sigma	M2643	Tl + stimolo tampone
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + stimolo tampone
D-Glucosio	Sigma	G7528	Tl + stimolo tampone
Solfato di tallio	Aldrich	204625	Tl + stimolo tampone
HEPES	Sigma	H4034	Tl + stimolo tampone
DMSO	Sigma	D4540	Solvente
Otto-canale elettronico pipetta	Biohit	E300	Placcatura cella in 384 -pozzetti
BD PureCoat ammina rivestite piastre a 384 pozzetti	BD Biosciences	356719	Dosaggio micropiastre
Echo qualificato 384-Well polipropilene micropiastre (384PP)	Labcyte	P-05.525	Composti di origine micropiastre
384 pozzetti in polipropilene micropiastre	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagente dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 Lavatore	BioTek	ELx405HT	Cella di lavaggio automatico
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo piattaforma automatizzata di gestione dei liquidi	Agilent Technologies	Modello di serie
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic immagini lettore di piastre