Descriviamo un metodo per modificare geneticamente primarie cellule T umane con un transgene utilizzando il non virale PiggyBac Trasposone sistema. Cellule T modificata per usare la PiggyBac Trasposone mostra sistema stabile espressione del transgene.
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Articolo metodologico
piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema piggyBac trasposoni è naturalmente attivo, originariamente derivato dal 1,2 cavolo crochet falena. Questo non virale sistema è basato plasmide, più comunemente utilizzando due plasmidi con uno esprimere l'enzima piggyBac trasposasi e un trasposone plasmide ospitare il gene (s) di interesse tra elementi ripetute invertite che sono necessarie per l'attività di trasferimento genico. PiggyBac trasferimento genico media attraverso un meccanismo "taglia e incolla" che la trasposasi integra il segmento trasposoni nel genoma della cellula bersaglio (s) di interesse. PiggyBac è dimostrato efficace attività consegna del gene in una vasta gamma di 1,2 insetto, mammifero 3-5, e umano cells6 inclusione dei linfociti T umani 7,8. Recentemente, un trasposasi iperattivo piggyBac è stata generata migliorare l'efficienza di trasferimento genico 9,10.
Linfociti T umani sono di intere clinicast per l'immunoterapia adottiva del cancro 11. Da segnalare, il primo studio clinico che ha coinvolto la modifica trasposone delle cellule T umane che utilizzano il sistema di trasposoni Sleeping Beauty è stato approvato 12. Abbiamo precedentemente valutato l'utilità della piggyBac come non virale metodologia per modificazione genetica di cellule T umane. Abbiamo trovato piggyBac essere efficiente una modificazione genetica di cellule T con un gene reporter e un non immunogeno gene suicida inducibile 7. Analisi dei siti di integrazione genomica ha rivelato una mancanza di preferenza per l'integrazione in zona di noti proto-oncogeni 13. Abbiamo usato piggyBac per modificare gene-linfociti T citotossici per trasportare un antigene recettore chimerico diretto contro l'antigene tumorale HER2, e trovato che geni modificati cellule T mediato mirata uccisione delle cellule tumorali HER2-positivi in vitro e in vivo in un modello di topo ortotopico 14. Abbiamo anche utilizzato piggyBacper generare cellule T resistenti alla rapamicina, che dovrebbero essere utili nelle terapie del cancro in cui è utilizzato rapamicina 15.
Qui, si descrive un metodo per utilizzare piggyBac modificare geneticamente primarie cellule T umane. Questo include isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da sangue umano seguita dalla cultura, modificazione genetica, e l'attivazione di cellule T. Ai fini della presente relazione, le cellule T sono state modificate con un gene reporter (eGFP) per l'analisi e la quantificazione dell'espressione genica mediante citometria a flusso.
PiggyBac può essere utilizzato per modificare cellule T con una varietà di geni di interesse. Anche se abbiamo usato piggyBac per dirigere le cellule T ad antigeni tumorali 14, abbiamo usato anche piggyBac per aggiungere un interruttore di sicurezza inducibile per eliminare cellule gene modificato se necessario 7. La capacità di carico di grandi dimensioni di piggyBac ha anche permesso di trasferimento genicoun grande rapamicina mTOR molecola resistente (15 kb) 15. Pertanto, presentiamo una non virale metodologia stabile gene-modifica di cellule T umane primarie per una varietà di scopi.
Protocollo
Giorno 0
1. Isolamento di PBMC da sangue umano
- Raccogliere 20 ml di sangue umano fresco con prelievo venoso in Na-eparina vacutainer.
- Mix sangue e Advanced RPMI 1640 in 1:1 (v / v) rapporto.
- Aggiungere 20 ml di mezzo Lymphoprep un tubo da centrifuga da 50 ml (25 ° C). Lentamente strato 25-30 ml di sangue RPMI-1640 mix sopra il Lymphoprep.
- Centrifugare a 400 xg per 40 min senza freni.
- Raccogliere sia strati distinti e fuzzy utilizzando una pipetta monouso in 10 ml di PBS 1x (25 ° C) e portare il volume a 50 ml con PBS 1x.
- Centrifugare a 450 xg per 10 min.
- Aspirare il surnatante completamente e aggiungere 20 ml di RPMI 1640 Avanzata.
- Centrifugare a 400 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 10 ml di mezzi completi cellule T integrato con 5 ng / ml rhIL-15 preriscaldato a 37 ° C.
- Contare il numero di cellule e la piastra in un cappotto coltura tissutale a 24 pozzettipiastra ed a 2 x 10 6 cellule / pozzetto in completo supporto delle cellule T integrato con 5 ng / ml rhIL-15 Aggiungi acqua sterile per pozzi circostanti. Incubare per una notte in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 1
2. Piastre con rivestimento anti-CD28 e anti-CD3 per stimolare le cellule T
- Diluire anti-CD28 e anti-CD3 anticorpi in acqua sterile alla concentrazione di 1 ug / ml ciascuno.
- Aggiungere 500 ul di soluzione ogni anticorpo a 5 pozzetti marcati di un non-rivestito coltura di tessuti 24 pozzetti.
- Aggiungere acqua sterile a riposo dei pozzetti. Avvolgere la piastra in termoretraibile e mettere in un 4 ° C frigorifero.
3. Nucleofection di non stimolato cellule T
- Preriscaldare supporti delle cellule T a 37 ° C e con supplemento di 5 ng / ml di rhIL-15. Preparare soluzione completa Nucleofector con l'aggiunta di 500 microlitri del Supplemento Nucleofector 1-2,25 ml di soluzione Nucleofector.
- Laliquot 5 pg ognuno di trasposoni (Zeo-pT-CMV-eGFP) e transposasi (pCMV-piggyBac) in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Nota: potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità e trasposasi DNA trasposone per il trasferimento genico ottimale e per minimizzare tossicità cellulare. I plasmidi possono essere ottenuti da autori richiesta.
- PBMC raccolta dalla piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti in un tubo da 50 ml. Contare il numero di cellule. Salvare 2 x 10 6 cellule per uso come controllo durante citometria a flusso.
- Aggiungere 7-10 x 10 6 cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 400 xg, 5 min, Aspirare il surnatante e finger-flick il pellet.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di cellule T nucleofection completo al pellet allentato.
- Aggiungere la soluzione di cellule miscela nella provetta contenente i plasmidi.
- Aggiungere la soluzione-cellula-plasmide miscela al fondo della cuvetta nucleofection. Fare attenzione a non introdurre bolle.
- Nucleofect le cellule che utilizzano programmo U-014 (non stimolate le cellule T, umane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Immediatamente aggiungere 500 microlitri di media preriscaldata con rhIL-15 alla cuvetta. Trasferire le cellule ad un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 1,5 ml di mezzo preriscaldata con rhIL15.
- Incubare per una notte in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 2
4. La stimolazione non specifica delle cellule T
- Harvest cellule e determinare il numero di cellule. Annullare 0,5 x 10 6 cellule per citometria a flusso per determinare la frequenza di cellule GFP-positive. Utilizzare i non transfettate PBMC come controlli.
- Aspirare la soluzione di anticorpi CD3/28 dalla piastra di coltura tissutale non rivestito e lavare ogni pozzetto con supporto di cellule T.
- Risospendere le cellule nucleofected a 0,5 x 10 6 cellule per ml in mezzi completi CTLsupplementato con 5 ng / ml rhIL-15. Aggiungere 2,0 ml ciascuna delle celle nucleofected in 4 pozzetti della piastra non coltura tissutale. Aggiungere 0,5 x 10 6 cellule non nucleofected al 5 bene.
- Incubare per 3 giorni in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 5
- Raccogliere le cellule T stimolate dalla non rivestita piastra di coltura tissutale.
- Contare e replate le cellule in una piastra a 24 tessuto ben ricoperto coltura a 0,7 x 10 6 cellule / ml in mezzi di cellule T con 5 ng / ml di IL-15.
7 ° giorno
7. L'analisi dell'espressione genica
- Cellule Harvest e macchia con anti-umano CD8 (potrebbe anche usare anti-CD3 e anti-CD4) e analizzare con citometria a flusso per l'espressione% GFP.
8 ° giorno (opzionale)
8. L'espansione delle cellule T
- Il giorno 8 dopo la trasfezione, le cellule T possono essere saltuariamente a T-Cellule supporto con IL-15 ad una densità di 0,7 x 10 6 cellule per pozzetto per un'ulteriore espansione 16.
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Risultati
Uno schema dimostrando i passaggi modificare geneticamente linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è mostrato in Figura 1. Questi plasmidi sono disponibili su richiesta presso gli autori. Un schemtic dimostrando i passaggi geneticamente modificati linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è showin in Figura 2. È necessario attivare le cellule T in modo da farli dividere, espandere e diffondere nella cultura. Modificati cellule umane T sono state poi coltivate ed analizzate in ...
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Discussione
Il metodo qui descritto consente la modifica stabile del transgene primari linfociti T umani. Abbiamo precedentemente testato l'utilizzo del sistema piggyBac trasposone per modificare le cellule T per esprimere un gene reporter (per più di 4 settimane), un non immunogeno gene suicida, un recettore antigene chimerico per immunoterapia adottiva (per più di 100 giorni), e per progettare la resistenza ai farmaci immunosoppressivi 7,13-15. Non virale modifica di cellule T per l'immunoterapia adott...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
SS è sostenuto in parte dal Med HHMI in Grad formazione di sovvenzione attraverso il Programma TBMM. MHW è sostenuto in parte da un premio alla carriera sviluppo dal Department of Veterans Affairs e il generoso sostegno del Dr. Harold e la signora M. Selzman. Questo lavoro è stato supportato anche in parte da linfoma NIH SPORE concessione P50CA126752 e NIH R01 DK093660.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Avanzata RPMI 1640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone siero fetale bovino | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| Glutamax-I Supplemento | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| IL-15 umana ricombinante Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Kit Maxi Plasmid | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | & Nbsp; |
| Umano delle cellule T Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| Tavola 24 Tissue Culture trattati bene | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Tissue Culture Beh non trattato Piatto | BD Falcon | 351147 | |
| Completa delle cellule T supporti composizione 1x avanzata RPMI 1640 5% di calore siero fetale bovino inattivato 2 mM GlutamaxIM-I |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
