piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

Sommario

Descriviamo un metodo per modificare geneticamente primarie cellule T umane con un transgene utilizzando il non virale PiggyBac Trasposone sistema. Cellule T modificata per usare la PiggyBac Trasposone mostra sistema stabile espressione del transgene.

Abstract

Il sistema piggyBac trasposoni è naturalmente attivo, originariamente derivato dal ^1,2 cavolo crochet falena. Questo non virale sistema è basato plasmide, più comunemente utilizzando due plasmidi con uno esprimere l'enzima piggyBac trasposasi e un trasposone plasmide ospitare il gene (s) di interesse tra elementi ripetute invertite che sono necessarie per l'attività di trasferimento genico. PiggyBac trasferimento genico media attraverso un meccanismo "taglia e incolla" che la trasposasi integra il segmento trasposoni nel genoma della cellula bersaglio (s) di interesse. PiggyBac è dimostrato efficace attività consegna del gene in una vasta gamma di ^1,2 insetto, mammifero ^3-5, e umano cells6 inclusione dei linfociti T umani ^7,8. Recentemente, un trasposasi iperattivo piggyBac è stata generata migliorare l'efficienza di trasferimento genico ^9,10.

Linfociti T umani sono di intere clinicast per l'immunoterapia adottiva del cancro ^11. Da segnalare, il primo studio clinico che ha coinvolto la modifica trasposone delle cellule T umane che utilizzano il sistema di trasposoni Sleeping Beauty è stato approvato ^12. Abbiamo precedentemente valutato l'utilità della piggyBac come non virale metodologia per modificazione genetica di cellule T umane. Abbiamo trovato piggyBac essere efficiente una modificazione genetica di cellule T con un gene reporter e un non immunogeno gene suicida inducibile ^7. Analisi dei siti di integrazione genomica ha rivelato una mancanza di preferenza per l'integrazione in zona di noti proto-oncogeni ^13. Abbiamo usato piggyBac per modificare gene-linfociti T citotossici per trasportare un antigene recettore chimerico diretto contro l'antigene tumorale HER2, e trovato che geni modificati cellule T mediato mirata uccisione delle cellule tumorali HER2-positivi in vitro e in vivo in un modello di topo ortotopico ^14. Abbiamo anche utilizzato piggyBacper generare cellule T resistenti alla rapamicina, che dovrebbero essere utili nelle terapie del cancro in cui è utilizzato rapamicina ^15.

Qui, si descrive un metodo per utilizzare piggyBac modificare geneticamente primarie cellule T umane. Questo include isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da sangue umano seguita dalla cultura, modificazione genetica, e l'attivazione di cellule T. Ai fini della presente relazione, le cellule T sono state modificate con un gene reporter (eGFP) per l'analisi e la quantificazione dell'espressione genica mediante citometria a flusso.

PiggyBac può essere utilizzato per modificare cellule T con una varietà di geni di interesse. Anche se abbiamo usato piggyBac per dirigere le cellule T ad antigeni tumorali ^14, abbiamo usato anche piggyBac per aggiungere un interruttore di sicurezza inducibile per eliminare cellule gene modificato se necessario ^7. La capacità di carico di grandi dimensioni di piggyBac ha anche permesso di trasferimento genicoun grande rapamicina mTOR molecola resistente (15 kb) ^15. Pertanto, presentiamo una non virale metodologia stabile gene-modifica di cellule T umane primarie per una varietà di scopi.

Protocollo

Giorno 0

1. Isolamento di PBMC da sangue umano

1. Raccogliere 20 ml di sangue umano fresco con prelievo venoso in Na-eparina vacutainer.
2. Mix sangue e Advanced RPMI 1640 in 1:1 (v / v) rapporto.
3. Aggiungere 20 ml di mezzo Lymphoprep un tubo da centrifuga da 50 ml (25 ° C). Lentamente strato 25-30 ml di sangue RPMI-1640 mix sopra il Lymphoprep.
4. Centrifugare a 400 xg per 40 min senza freni.
5. Raccogliere sia strati distinti e fuzzy utilizzando una pipetta monouso in 10 ml di PBS 1x (25 ° C) e portare il volume a 50 ml con PBS 1x.
6. Centrifugare a 450 xg per 10 min.
7. Aspirare il surna....

Risultati

Uno schema dimostrando i passaggi modificare geneticamente linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è mostrato in Figura 1. Questi plasmidi sono disponibili su richiesta presso gli autori. Un schemtic dimostrando i passaggi geneticamente modificati linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è showin in Figura 2. È necessario attivare le cellule T in modo da farli dividere, espandere e diffondere nella cultura. Modificati cellule umane T sono state poi coltivate ed analizzate in .......

Discussione

Il metodo qui descritto consente la modifica stabile del transgene primari linfociti T umani. Abbiamo precedentemente testato l'utilizzo del sistema piggyBac trasposone per modificare le cellule T per esprimere un gene reporter (per più di 4 settimane), un non immunogeno gene suicida, un recettore antigene chimerico per immunoterapia adottiva (per più di 100 giorni), e per progettare la resistenza ai farmaci immunosoppressivi ^7,13-15. Non virale modifica di cellule T per l'immunoterapia adott.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Lympholyte	Cedarlane	CL5015
Avanzata RPMI 1640	LifeTechnologies	12633020
Hyclone siero fetale bovino	Fisher Scientific	SH3008803
Glutamax-I Supplemento	LifeTechnologies	35050-061
IL-15 umana ricombinante Protein	eBioscience	14-8159
EndoFree Kit Maxi Plasmid	Qiagen	12362
Amaxa Nucleofector	Lonza	AAD-1001S	& Nbsp;
Umano delle cellule T Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1002
CD8-APC	Southern Biotech	9536-11
Anti-Human CD3	eBioscience	16-0037-81
Anti-Human CD28	BD Pharmingen	555725
Tavola 24 Tissue Culture trattati bene	BD Falcon	353047
24 Tissue Culture Beh non trattato Piatto	BD Falcon	351147
			Completa delle cellule T supporti composizione 1x avanzata RPMI 1640 5% di calore siero fetale bovino inattivato 2 mM GlutamaxIM-I