Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Sommario

Stiamo descrivendo un nuovo procedimento per isolare DNA genomico da sangue intero prelevato per plasma / sierologia. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene solitamente scartata. Il nostro nuovo metodo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai metodi esistenti e rende il DNA e plasma disponibili da una singola collezione, senza richiedere ulteriore sangue.

Abstract

Test di laboratorio possono essere praticati sulle porzioni cellulari o fluido del sangue. L'uso di diverse provette determina la porzione del sangue che può essere analizzato (sangue intero, plasma o siero). Laboratori coinvolti nello studio delle basi genetiche delle malattie umane si basano su anticoagulante del sangue intero prelevato in EDTA contenente vacutainer come fonte di DNA per l'analisi genetica / genomica. Perché laboratori clinici di eseguire più test biochimici, sierologici e virali come un primo passo in un'indagine risultato fenotipico, il sangue coagulato è anche raccolto in provetta contenente eparina (tubo plasma). Pertanto quando sono necessarie DNA e plasma per analisi simultanea e parallela di dati sia genomici e proteomici, è consuetudine per raccogliere il sangue in EDTA e sia con eparina. Se sangue potrebbe essere raccolto in un unico tubo e servire come fonte sia per plasma e DNA, tale metodo sarebbe considerato un avanzamento a met esistentiods. L'utilizzo del sangue compattato dopo estrazione plasma rappresenta una fonte alternativa per il DNA genomico, minimizzando così la quantità di campioni di sangue trasformati e riducendo il numero di campioni richiesti da ogni paziente. Ciò finirebbe per risparmiare tempo e risorse.

Il P100 sistema di raccolta del sangue BD per la conservazione delle proteine ​​del plasma sono stati creati come un metodo migliorato nel corso del plasma precedente o raccolta siero tubi ^1, per stabilizzare il contenuto proteico del sangue, consentendo una migliore proteina scoperta di biomarcatori e proteomica sperimentazione dal sangue umano. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml di K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plasmatiche. Essi includono anche un separatore meccanico, che fornisce una barriera fisica tra plasma e pellet cellulari dopo centrifugazione. Pochi metodi sono stati studiati per estrarre il DNA da sangue coagulato SAmples raccolti nei vecchi tubi di plasma ^2-4. Sfide da questi metodi sono stati principalmente associati con il tipo di separatore all'interno dei tubi (separatore di gel) ed inclusi difficoltà di recupero del sangue coagulato, l'inconveniente di frammentare o disperdendo il coagulo e ostruzione del coagulo estrazione dal gel di separazione.

Vi presentiamo il primo metodo che estrae e purifica il DNA genomico da sangue prelevato nei nuovi P100 tubi BD. Si confronta la qualità del campione di DNA da P100 tubi, a quella in provette EDTA. Il nostro approccio è semplice ed efficiente. Si tratta di quattro fasi principali, come segue: 1) l'uso di un BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubo con separatore meccanico per la raccolta del sangue, 2) la rimozione del separatore meccanico utilizzando una combinazione di saccarosio e di un sterile graffetta gancio metallico, 3) la separazione dello strato di buffy coat contenente le cellule bianche e 4) l'isolamento del DNA genomico dalbuffy coat utilizzando un kit di estrazione del DNA normale commerciale o un protocollo standard simile.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere campioni di sangue di soggetti con adeguata consenso informato. Per ogni individuo, trarre 4-5 ml di sangue in una provetta P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). A scopo di confronto, raccogliere contemporaneamente il sangue in una provetta con EDTA.
2. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plasmatiche. Essi contengono anche un separatore meccanico. Dopo aver raccolto il sangue intero, mantenere entrambi i tubi a temperatura ambiente per 60 min a....

Risultati

Valutazione della qualità del DNA e la misura della concentrazione

Le rese di P100_DNAs erano significativamente inferiori a quelli di EDTA_DNAs (Tabelle 1 e 2). La purezza del DNA rappresentata dal valore 260/280 rapporto è simile per entrambi P100_DNA e set di esempio EDTA_DNA (Tabelle 1 e 2). La qualità del DNA è abbastanza uniforme all'interno di ogni serie di campioni sebbene alcuni degradazione è visto nei campioni ED.......

Discussione

Molte malattie umane hanno cause genetiche ed esplorare la base genetica delle malattie umane richiede una crescente DNA di alta qualità. La fonte più comune di DNA utilizzato in studi genetici è coagulato sangue intero. Poiché laboratori più eseguire test biochimici clinici, sierologici, e virali come primo passo in esito indagine fenotipica, il sangue viene spesso raccolta in un tubo plasma. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene spesso scartato. Pertanto, quando il DNA è necessario per condurre studi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi BD P100	BD Diagnostics	366448
Tubi EDTA	BD Diagnostics	367863
Saccarosio	Sigma	S9378
Clip per fogli	Prodotto da ufficio
Tubo da 15 ml	Corning	430052
Emazie (globuli rossi, RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Buffer salino fosfato (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
Micotubi da 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Kit Human Immuno DNA Analysis BeadChip	Illumina	WG-352-1001
Lettore di matrici a perline	Illumina	NA
Software GenomeStudio	Illumina	N/A