Questo articolo descrive un metodo con il quale si può imitare In vivo Sviluppo del Drosophila Corpo funghi in un Ex vivo Sistema di coltura.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Noi descriviamo un metodo per la coltura ex vivo di interi cervelli Drosophila. Questo può essere usato come un contrappunto al croniche manipolazioni genetiche per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo delle strutture cerebrali centrali, consentendo acuti interventi farmacologici e immagini dal vivo di processi cellulari. Come esempio della tecnica, prima lavorare dal nostro laboratorio 1 ha dimostrato che un vano precedentemente non subcellulare compreso tra i vani assonale e somatodendritic di assoni del cervello Drosophila centrale. Lo sviluppo di questo vano, indicato come il segmento assone iniziale (AIS) 2, è stato dimostrato geneticamente dipendere dalla chinasi neurone-specifica ciclina-dipendente, Cdk5. Mostriamo qui che il trattamento ex vivo delle wild-type cervelli larvali di Drosophila con la Cdk5-inibitori farmacologici specifici roscovitine e olomoucine 3 produce modifiche acute nell'organizzazione actina enella localizzazione della proteina Fasciclin superficie cellulare 2, che imitano i cambiamenti visti in mutanti che mancano Cdk5 attività geneticamente.
Un secondo esempio di tecnica di coltura ex vivo è previsto per il rimodellamento dei collegamenti del corpo fungo embrionale (MB) neuroni gamma durante la metamorfosi da larva ad adulto. Il corpo fungo è il centro di apprendimento e la memoria olfattiva in volo 4, e questi neuroni gamma potare i rami assonali e dendritiche durante lo sviluppo pupale e poi ri-rami si estendono in un timepoint tardi per stabilire il modello di adulto innervazione 5. Potatura di questi neuroni del MB è stato verificato tramite degenerazione locale di rami neuriti 6, da un meccanismo che viene attivato da ecdisone, un ormone steroideo, agendo sul recettore B1 ecdisone 7, e che dipende dall'attività del sistema ubiquitina-proteasoma 6. Il nostro metodo di coltura ex vivo possono be utilizzato per interrogare ulteriormente il meccanismo di rimodellamento sviluppo. Abbiamo trovato che l'impostazione in coltura ex vivo, neuroni gamma di MB ricapitolato il processo di potatura di sviluppo con un percorso simile a quello che in vivo. È essenziale, tuttavia, attendere 1,5 ore dopo la formazione pupario prima espianto il tessuto affinché le cellule ad impegnarsi irreversibilmente a metamorfosi; dissezione degli animali durante l'insorgenza di pupariation portato a metamorfosi poco o nessun in coltura. Così, con opportune modifiche, l'approccio coltura ex vivo può essere applicato allo studio dinamico così come aspetti allo stato stazionario di biologia cervello centrale.
Protocollo
A. Preparazione di Media
- Preparare mezzi completi da filtro sterilizzante Schneider Drosophila mezzo supplementato con 10% siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina.
- Supporto deve essere preparato fresco ogni volta. In alternativa, una nuova aliquota di pre-congelati i media possono essere scongelati prima di ogni utilizzo.
- Prima di coltura, aggiungere 10 mg / ml di insulina e 2 mg / ml ecdisone ai media. I farmaci sono stati preparati come scorte concentrati e congelata in piccole aliquote. Aliquote non erano scongelati ricongelato.
- Tutte le soluzioni di lavoro deve essere mantenuta a 25 ° C.
La coltivazione di cervelli larvali
1. Selezione e dissezione di cervelli larvali
- Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile.
- Aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione.
- Ucantare una piccola spatola, raccogliere vagare larve terzo stadio e metterli in vetro di orologio. (Si presume che il metodo di coltura ex vivo si applica altrettanto bene al primo o al secondo stadio le larve, ma non abbiamo testato questo.)
- Tenendo l'estremità posteriore della larva con una coppia di pinze, accuratamente aprire l'estremità anteriore con una seconda coppia di pinze # 5.
- Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta.
2. Ex vivo di coltura sezionati cervelli larvali
- Utilizzando pre-bagnato puntali, trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media.
- Cervelli di trasferimento, in media, a un incubatore a 25 ° C fino al punto temporale desiderato viene raggiunto. Questo metodo funziona in modo efficiente per un massimo di 48 ore nella cultura.
- Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a ciò, sostituire la metà dei mezzi di ogni 5-6 ore.
3. La manipolazione farmacologica dellaBrains larvali
Questo metodo di coltura ex vivo può essere utilizzato per corroborare farmacologicamente interazioni genetiche precedentemente dimostrato nel nostro laboratorio 1.
- Aggiungere 100 roscovitine uM e 100 micron a olomoucine supporti preparati.
- Trasferimento cervelli sezionati a questo media.
- Cervelli cultura a 25 ° C per 24 ore.
- Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a questo, sostituire la metà dei media (con farmaci) ogni 5-6 ore.
La coltivazione di Brains pupa
1. Selezione di Pupae per dissezione
- Segna pupe bianco su bottiglie / flaconi.
- Scegliere solo pupe che sono completamente bianchi. Pupe con qualsiasi tipo di colorazione non dovrebbe essere incluso.
- Questa fase è 0 ore dopo la formazione pupario (APF).
- Questi pupe sarà pronto per dissezione 1,5 ore dopo la marcatura. Questo passo è fondamentale per assicurare che la potatura di sviluppo avviene in ex vivo cultura.
2. Dissezione di Pupae
- Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. (I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile).
- Una volta che il desiderato punto temporale è stato raggiunto, aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione.
- Utilizzando una piccola spatola bagnata, pick up pupe precedentemente segnato per la dissezione e metterli in vetro di orologio.
- Tenendo l'estremità posteriore del pupe con una coppia di pinze, accuratamente aprire l'estremità anteriore del caso pupa con una seconda coppia di pinze # 5.
- Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta e allegato.
3. Coltura ex vivo di sezionati Brains pupa
- Trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media.
- Cervelli di trasferimento, in media, ad un incubatore a 25 ° C fino alla desiderata time-point viene raggiunto. Abbiamo usato questo metodo per un massimo di 10 ore in coltura per l'esperimento illustrato, ma può essere esteso a lunghi periodi di osservazione e di trattamento, se necessario.
- Per i punti temporali più di 8 ore APF, sostituire i supporti ogni 5-6 ore.
Da questo passo, il protocollo rimane invariato sia per larve e pupe.
B. Fissaggio Brains sezionati
- Una volta che il desiderato punto temporale viene raggiunto, rimuovere i supporti e aggiungere 500 microlitri del 4% formaldeide in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 (PBST) per 30 minuti, sostituendo con formaldeide fresco dopo 15 minuti.
- Assicurarsi di non permettere il cervello per asciugare durante la sostituzione media con fissativo.
- Lavare formaldeide con quattro lavaggi 10 minuti di 1x PBS con 0,5% Triton X-100 (PBST).
C. colorazione Brains fissi
- Dopo formaldeide è stato lavato via, blocco cervello per 1 ora in una soluzione bloccante di 1x PBS con 1% normaleSiero di capra e l'1% albumina di siero bovino.
- Aggiungi anticorpi primari realizzati con la stessa soluzione bloccante.
- Cervelli Incubare per una notte a 4 ° C.
- La mattina dopo, lavare gli anticorpi primari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST.
- Aggiungere anticorpi secondari costituiti in soluzione bloccante.
- Lasciare a temperatura ambiente per 4 ore.
- Lavare anticorpi secondari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST.
D. Montaggio Brains fissate e colorate per la microscopia
- Equilibrare il cervello nei media Vectashield di montaggio per 1 ora.
- Montare il cervello su vetrini utilizzando i mezzi di comunicazione Vectashield di montaggio.
- Posizionare chip vetro su entrambi i lati del cervello prima di montare il vetrino coprioggetto. Ciò impedisce ai cervelli di essere schiacciato, mantenendo campione abbastanza sottile per analizzare tutti i piani focali con un microscopio confocale. Cervelli sono stati circa orientati su di montaggio per facilitare la visualizzazione delle caratteristiche di interesse. Se necessario,immagini del cervello erano alternate con il software Imaris per fornire una visione ottimale per la documentazione e la misurazione.
- Guarnizione del coperchio scivola con smalto trasparente.
- Conservare scivola al riparo dalla luce.
E. rappresentativi Risultati
La figura 1 mostra un pannello di cervelli larvali terzo instar di (A) wild-type mosche e (B) mosche che esprimono una posizione dominante-negativo derivato del Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Entrambi esprimono actina-GFP (green) nei neuroni gamma MB. Come descritto in precedenza (Trunova et al., 2011), c'è una regione negli assoni prossimali di wild-type neuroni gamma che non riesce ad accumulare actina-GFP, mostrando quindi come una "zona chiara" (A, staffa), e fasciclin due proteine (rosso) si accumula nelle assoni solo fino al confine di questa zona ventrale (linea bianca orizzontale). La linea tratteggiata nel terzo pannello di figura 1 (A) indica la posizione del MB, evidenziando l'attoin "zona chiara" e il suo margine ventrale. In mosche esprimono Cdk5DN, la zona chiara actina è assente (B) e Fasciclin 2 (FasII) immunoreattività dorsalmente diffonde attraverso quella regione. (Si noti che un numero variabile di FasII positivo progetto di assoni in orizzontale tutta la MB, queste non sono rilevanti per il fenotipo). Barra della scala rappresenta 20 micron.
Utilizzando il nostro metodo di coltura ex vivo, abbiamo trattato wild-type mosche con una combinazione di roscovitine e olomoucine, inibitori farmacologici di Cdk5 attività. La figura 2 mostra un pannello di cittadini di instar cervelli larvali di controllo (A) e farmaco-trattata (B wild-type) mosche. Simile a mosche che esprimono un dominante negativo Cdk5 costrutto, cervelli trattati con inibitori Cdk5 per 24 ore, mostrano la perdita caratteristica della zona di actina chiaro e spostamento di confine FasII (parentesi quadre). Linee bianche indicano la posizione di wild-type confine FasII. Barra della scala rappresenta 20 micron.
Figusull'articolo 3, mostra una serie rappresentante degli enti di funghi Drosophila da 0-10 ore APF, etichettati con membrana mirati mCD8-GFP (verde). Parentesi indicano il calice, cioè, le proiezioni dendritiche del MB. Prima della metamorfosi, si possono vedere gli assoni MB scorrono dorso-ventrale in grossi fasci, così come una 'nebbia' del segnale fluorescente derivante dalla dendritica arbor densa (staffa). Un pannello spettacoli cervelli sezionati al momento indicato. Si noti la potatura dei dendriti nella regione indicata dalle parentesi, in modo tale che entro 6-8 ore APF, la foschia del segnale dendritica è andato (anche se il segnale assonale è invariato). Brains nel pannello B sono stati sezionati a 0 ore APF, prima interna ecdisone spike (Truman e Riddiford, 2002), e coltivate ex vivo come indicato. Questi mostrano nessuna potatura di sviluppo dei dendriti, ma piuttosto il segnale dendritica persiste a 10 ore APF. Per ovviare a questo, le pupe sono contrassegnati APF a 0 ore, ma sezionato a 1,5 ore APF e colta. Vetrol C mostra una serie rappresentante degli enti di funghi queste Drosophila APF da 0-10 ore. Come nei non-coltura di campioni, il segnale dendritica non è rilevabile da 8 ore APF. Barra della scala rappresenta 20 micron.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Croniche manipolazioni genetiche di struttura del tessuto e funzione, tra cui le mutazioni ed espressione dei transgeni, in genere producono una combinazione di effetti immediati e tardivi conseguenze indirette che possono essere molto difficili da separare. Integrare i metodi genetici con la farmacologia può facilitare l'interrogatorio del corso tempo dietro un fenotipo. Ad esempio, questo è un approccio efficace per sezionare i contributi dei vari componenti citoscheletrici durante la spermatogenesi in D...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare tutti i membri del nostro laboratorio per i loro consigli, utili discussioni e commenti sul manoscritto. Vorremmo inoltre particolarmente ringraziare Marta Koch e Bassem Hassan per il suggerimento eccellente che aspettiamo fino a 1,5 ore APF prima sezionare il cervello per la coltura in esperimenti di rimodellamento. Ringraziamo anche la possibilità di imaging NHGRI per l'utilizzo del loro microscopio confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Neuroscienze di base del Programma di NINDS ricerca intramurale, NIH (NS003106 Z01).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Concentrazione finale |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Siero bovino fetale (inattivato al calore) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillina / streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulina | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdisone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Siero di capra normale | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Albumina di siero bovino | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | 0,5% |
| Soluzione tampone fosfato | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell colture cellulari Inserti | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 e | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont # 5 Pinze | Strumenti di Scienze Belle | 11251-20 | |
| Vetrini | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Vetro di copertura | Fisher Scientific | 12-548-5M |
Riferimenti
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
